［摘要］虾青素(astaxanthin)具有抗氧化、抗癌变、增强免疫等功能,可用作抗癌变预防治 疗剂、抗衰老剂、饲料添加剂、食品和化妆品的着色剂,是一种具有很大发展前途的新 资源性天然产物雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是天然虾青素的重要来源，但 是，雨生红球藻的养殖与保存相对来说比较困难，所以一直是不少科研人员的研究对 象试验首先在最适生长条件下培养雨生红球藻的运动细胞，使游动细胞的细胞密度 变的尽可能的高，培养条件为：光照强度1000〜1500 lx；光照周期24 h；光质为LED 白光；温度为室温10±1 °C ；通空气；初始pH-7.0然后改变培养基的成分，探讨单 因素条件对虾青素积累量的影响，实验条件：光照强度15000〜20000 lx；光照周期24 h； 光质为LED白光；温度为室温17±1C ；不通气；初始pH-7.0最终的结果表明，在 氮饥的饿情况下虾青素百分含量为 3.465%和 3.484%，磷饥饿情况下虾青素百分含量 为1.414%和1.435%，盐胁迫环境下虾青素百分含量为0.738%和0.650%，说明氮元素 的缺乏比磷元素的缺乏和盐胁迫，更有利于雨生红球藻积累虾青素。
［关键词］ 虾青素;氮饥饿;磷饥饿;盐胁迫Abstract: Astaxanthin has antioxidant, anticancer and function of enhancing immune. It can be used as anti-cancer prevention and treatment agent, anti-aging agent, feed additive and coloring agents of food and cosmetic . So it is a kind of promising “new resources of food” With the rapid development of medicine industry, food industry and aquaculture, the demand for Astaxanthin will must grow. In the experiment, the green movement cells of Haematococcus pluvialis were cultivated under optimal growth conditions in order to obtain maximum biomass. The conditions of culture were as following: light intensity was 1000〜1500 lx; light cycle was 24 h; light quality was white; temperature was 10± 1C andpH was about 7.0. Then the components of culture medium were changed for investigation on the effect of single factor on astaxanthin accumulation. The final results show that in the same external conditions, the lack of nitrogen was more conducive than those of phosphorus and salt stress to the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis.Key word: Astaxanthin, Nitrogen starvation, Phosphorus starvation, Salt stress.目录1 前 言 - 1 -1.1雨生红球藻 - 1 -1.1.1雨生红球藻形态及分类学特点 - 1 -1.1.2雨生红球藻生活周期 - 1 -1.1.3雨生红球藻培养 - 2 -1.1.4外界环境对雨生红球藻生长的影响 - 2 -1.2虾青素 - 2 -1.2.1虾青素的化学特征及来源 - 2 -1.2.2雨生红球藻细胞内虾青素合成及积累 - 3 -1.2.3外界环境对虾青素合成的影响 - 4 -1.2.4虾青素的生理功能及实际应用 - 4 -2 试验材料与方法 - 6 -2.1主要试验材料 - 6 -2.1.1藻种 - 6 -2.1.2主要试验试剂 - 6 -2.1.3主要试验仪器与设备 - 6 -2.2试验方法 - 7 -2.2.1雨生红球藻的培养 - 7 -2.2.2雨生红球藻的生长检测 - 7 -2.2.3虾青素的积累 - 7 -2.2.4虾青素含量的检测 - 7 -3 试验内容 - 8 -3.1雨生红球藻的培养 - 8 -3.1.1培养基的配置 - 8 -3.1.2试验材料的灭菌 - 8 -3.1.3接种 - 9 -3.1.4培养 - 9 -3.1.5生长检测 - 10 -3.2诱导虾青素 - 11 -3.3 虾青素含量的测定 - 12 -4 结果与讨论 - 13 -结 论 - 18 -参考文献 - 19 -致 谢 错误!未定义书签。
1.1.1 雨生红球藻形态及分类学特点雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在分类上属于绿藻门(Chlorophata)、绿藻纲 (Chlorophyceae)、团藻目(VolvocaleS)、红球藻科(Haem matococcaceae)、红球藻属 (Haematococcus, Ag) [1]雨生红球藻细胞的形状大多数呈现为广卵形，宽度约为19 pm 〜51 pm，长度约为28 pm〜63 pm雨生红球藻是单细胞藻类，用抱子或合子进行生殖, 内外细胞壁层的主要成分分别是是纤维素和果胶质，自由游动的雨生红球藻细胞大多 含有 2 条鞭毛，含有多个不规则的散布在原生质体内的伸缩泡由于游动的雨生红球 藻细胞内用于进行光合作用的色素成份含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素, 因此细胞呈绿色由于雨生红球藻的快速分裂生长和虾青素的大量累积不同步,使得很多学者在研 究雨生红球藻时观念的表述不清楚,造成了一定程度的混乱 Elliot、 Lee 以及刘建国 等先后对雨生红球藻的细胞形态和生活周期进行了系统的研究,对雨生红球藻研究文 献中出现的一些混乱观念进行了改正,将雨生红球藻的细胞形态描述为四种：(1) 游动细胞(motile cell),指游动阶段除游动抱子以外的细胞形式，细胞呈卵形或 椭圆形。
2) 动抱子(zoospore),可以由游动细胞和不动抱子在适宜条件下经过无性繁殖产 生繁殖过程中,由细胞壁演化成的抱子囊膨胀变大,从顶端逐步破裂释放出能自由 游动的子细胞这些从在母细胞内产生起到释放出抱子囊为止的具有游动能力的子细 胞称为游动抱子3) 静细胞(non- motile cell),指不运动阶段除不动抱子以外的细胞形态，在名称 上与游动阶段的游动细胞相呼应(4) 静抱子(aplanospore),不动阶段细胞表面上不游动呈静止状态，但是细胞不 一定处于静止的休眠状态实际上,该阶段细胞仍能进行分裂增殖,在母细胞内产生 没有鞭毛,发育至冲破细胞壁释放后也不能游动的子细胞这种由不动细胞经过无性 生殖方式产生,到从抱子囊内释放时期的子细胞称为不动抱子 [2] 1.1.2 雨生红球藻生活周期刘建国等 [3] 经过自己的观察和结合前人研究成果后认为,雨生红球藻的生活周 期主要如下：环境适宜时,游动细胞以有丝分裂的方式进行无性繁殖,多数母细胞产生 2-4 个 子细胞无论母细胞内有 2个或是 4个子细胞,都能观察到鞭毛的存在并能够自由游 动,属游动抱子,释放出的子细胞游动抱子成为新的游动细胞；不动细胞发育为抱子 母细胞和抱子囊,最终抱子从膨大的抱子囊壁中释放出来成为带有鞭毛的游动抱子并 残留下透明外壳。
环境不适时,游动细胞或者刚释放的游动抱子褪去鞭毛,直接转入 不动细胞阶段1.1.3 雨生红球藻培养虽然室外大池培养螺旋藻(Sp计ulina)和小球藻(Chlorella)已经获得成功，但因雨生 红球藻生长缓慢，容易被其他藻类如小球藻(Chlorella)、原生动物等污染[4]，因此有 人采用封闭玻璃管道培养雨生红球藻该方法虽然克服了微生物污染的问题，但是培 养成本相对提高了工业培养雨生红球藻多采用气升式反应器，实验室培养藻类多用 光照培养箱，将培养箱架上的日光灯作为光源，通过日光灯的数目和光照持续的时间 对光照强度和周期进行控制1.1.4 外界环境对雨生红球藻生长的影响(1) 光照光照是雨生红球藻生长的重要因素，最适宜雨生红球藻生长的光照强度数值大约 为30応/5飞)，高过50応/5飞)的光照会使分裂中的细胞由营养型转为休眠状态虽 然在黑暗条件下细胞能利用有机碳源 (如葡萄糖和醋酸盐)进行生长，但生长速率明显 低于有光的情况在30yE/(mSs)的光照条件下，持续光照与12 h光暗交替没有显著的 差异，但在大于50yE/(mJs)的光照条件下持续光照会显著抑制雨生红球藻的生长在小 于20yE/(mJs)的光照条件下持续光照反而有利于细胞的生长。
光质方面红光比蓝光对 雨生红球藻的生长更为有利 [5] 2) 温度最适于雨生红球藻光合自养生长的温度为25°C〜28°C,当温度高于30 °C时雨生红 球藻的生长会受到抑制但是较高的温度(如30 °C)有利于雨生红球藻利用有机碳源进 行混合培养，这可能是较高温度影响雨生红球藻异养生长所需的酶活性的缘故 [1] 3) pH雨生红球藻最适生长的pH为中性至微碱性(pH 7-8)，虽然有研究显示在强碱的环 境下红球藻仍然可以生长，但生长速率很低4) 溶解氧关于溶解氧对雨生红球藻生长的影响研究较少，目前认为较低的溶解氧(如 50%饱 和度)有利于雨生红球藻的自养生长，而饱和的溶解氧则有利于雨生红球藻进行异养生 长 [6] 5) 碳源及氮源不同科学家对雨生红球藻氮源的需要持不同的意见大部分的学者认为当硝酸铵 作为雨生红球藻的氮源时，首先被消耗利用的是铵离子，硝酸根离子只有在铵离子消 耗完之后才会被利用[7]Borowitzka等认为最好的氮源是质量浓度为0.5〜1.0 g/L的 硝酸盐醋酸盐是比较好的用于雨生红球藻混合培养的碳源，醋酸盐除了有利于雨生 红球藻的生长外，也很容易被雨生红球藻吸收参与虾青素的合成 [8] 。
1.2 虾青素1.2.1 虾青素的化学特征及来源虾青素(astaxanthin ,ASTA)的化学系统名(IUPAC)为3,3'-二羟基-卩0-胡萝卜素-4,4 '-二酮，分子式是C40H52O4,相对分子质量是596.86纯的虾青素颜色是暗红棕色，呈 粉末状，不溶于水，能溶于大多数的有机溶剂虾青素的化学结构是由四个异戊二烯单位以共轭双键型式联结，两端又有两个异戊二烯单位组成六节环结构虾青素含有 一个长的共轭不饱和双键系统，光、热、氧化物很容易破坏它的结构从生物体内提 取虾青素的过程中，酶的作用也会破坏虾青素的这种结构虾青素有三种不同的旋光 异构体(见图1), (A)是雨生红球藻生物合成的虾青素异构体，(B)是酵母菌合成的虾青 素异构体，(C)则是人工合成的虾青素异构体［9］图1虾青素的三种异构体Fig 1 The t。