专题1 基因工程※ 基因工程的诞生﹡20世纪中叶，基础理论取得了重大突破• DNA是遗传物质的证明：1944艾弗里等人• DNA双螺旋结构和中心法则的确立：1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型1958年，梅塞尔松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制，随后不久确立了中心法则• 遗传密码的破译：1963年，尼伦贝格等破译了遗传密码﹡技术的发明使基因工程的实施成为可能• 基因转移载体的发现• 工具酶的发明• DNA合成和测序技术的发明• DNA体外重组的实现• 重组DNA表达实验的成功：1973年，博耶和科恩将两种不同来源的DNA 分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达，至此，基因工程正式问世• 第一例转基因动物问世：1980年，科学家首次通过显微注射法，培育出世界上第一个转基因动物这一实验被认为是基因工程发展史上的一个里程碑PCR技术的发明：1985年，科学家莫里斯发明※ 基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因分子水平剪切→拼接→导入→表达人类需要的基因产物﹡原理：基因重组﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性﹡操作水平：DNA分子水平﹡实质：【思考】：（1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子一、基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端2.“分子缝合针”——DNA连接酶（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类（2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA双链单链模板不要模板要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质（4）与DNA分子相关的酶限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成粘性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子3.“分子运输车”——载体（1）作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制2）载体具备的条件：①能在受体细胞中自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择④大小合适，对受体细胞无害3）最常用的载体是 质粒它常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子4）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒4．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改选的答案与提示】（一）思考与探究 2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。
是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶二）寻根问底1.根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。
限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的2. DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNADNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来因此DNA连接酶不需要模板此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。
三）模拟制作讨论题1. 你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗？提示：不能因为一般基因有上千个碱基对2. 如果你操作失误，碱基不能配对可能是什么原因造成的？提示：可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）四）旁栏思考题想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等知识拓展】1.限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（图1-1），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的图1-1 限制酶识别序列的中心轴线2.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸序列，这是由限制酶的性质所决定的3.DNA连接酶连接的是什么部位？DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键二、基因工程的基本操作程序苏教版人教版1、获得目的基因1、目的基因的获取2、制备重组DNA分子2、基因表达载体的构建3、转化受体细胞3、将目的基因导入受体细胞4、筛选出获得目的基因的受体细胞4、目的基因的检测与鉴定5、培养受体细胞并诱导目的基因的表达步骤：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定第一步：目的基因的获取1.目的基因是指： 主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子 。
※ 基因的结构：基因是有遗传效应的DNA片段(注：RNA病毒为RNA)，分为编码区和非编码区编码区：能转录出mRNA，原核生物中也就是能编码蛋白质的区段非编码区：不能转录出mRNA，也不能编码蛋白质的区段※ 原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点真核细胞基因结构要比原核细胞的基因结构复杂，编码区间隔的、不连续，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式，分为：外显子：能够编码蛋白质的序列；内含子：不能够编码蛋白质的序列（１）原核细胞基因的结构非编码区中存在调控遗传信息表达的核苷酸序列:①编码区上游的RNA聚合酶结合位点，即启动子，可控制RNA聚合酶的结合RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并结合调控序列中的结合位点，能催化DNA转录为RNA②编码区下游有终止子，可控制RNA聚合酶的停止、脱落2）真核细胞基因的结构2.获目的基因的来源：从自然界中已有的物种中分离及人工合成3. 目的基因的获取方法：（1）从基因文库中获取（基因组文库、cDNA文库）※基本概念的理解：①将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
②将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后将这些片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段这个群体包含了这种生物的。