酶工程论文

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1、(I9zs600e)nwH 畫西北大学生物工程周智（2009115261）摘要：本文就几丁质酶的基本结构和功能作一概述并就其研究进展进行探究。 关键词：几丁质酶筛选方法测定方法性质功能几丁质是由N 乙酰-D-氨基葡萄糖以B-1, 4糖苷键连接而成的 高分子聚合物，广泛存在于自然界，特别是海洋中.据统计， 几丁质的全球年生物合成量超过山t,是仅次于纤维素的第二大可再生 资源.几丁质的降解产物几丁寡糖、壳 聚糖和N 乙酰氨基葡萄 糖具有抗菌、抗肿瘤等活性，因而具有广泛的应用前景，目前这些 产品一般用化学降解的方法来制取，造成较严重的环境污染，而 用几丁质酶降解法能克服这个缺点，而且能控制降解的程度

2、.1. 几丁质酶的简介催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺反应的酶。EC 3. 2. 1. 14。 是卡勒和霍夫曼（P. Karrer，A. Hofmann， 1929 ）从蜗牛（Helix pomatia ）的胃液（中肠腺分泌液）中发现的，性质不详。此外， 在昆虫的蜕皮腺分泌液中也可找到，具有消化和吸收老的角质层 的作用。在昆虫的蜕皮液、扁桃（almond ）的果皮和霉状菌中也 有所发现。几丁质又名甲壳胺，是甲壳类动物（如虾、蟹）、昆虫和其他 无脊椎动物外壳中的甲壳中的甲壳质，经脱乙酰化（提取）制得的一种 天然高分子多糖体，是动物性的食物纤维。几丁质脱 乙酰 化的程度越高，发挥的生理效应也越强，

3、尚赫几丁质脱乙酰度可 以达到来 90%以上。国际医学营养食品学会将 这种物质命名为除 糖、蛋白质、脂及、维生素和矿物质五大生命要素后的第六大生 命要素，因此越来越受到广泛关注，它完全不同于一般天然营养 品，它就是几丁质。2. 自然存在几丁质是广泛存在于宜然界的一种含氮多糖类生物性高分子，主要的来源为虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软件动物的器官（例如乌贼的软骨），以及 真菌类的细胞壁等。其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估计每年自然界生物的合成量可达1 X1011吨，仅次于纤维素。一般由虾蟹壳提炼的几丁质，约含有15%的胺基（-NH2 ）与85%的乙醯基（-C0CH3）。几丁质不溶于一般

4、的弱无机酸或有机溶剂，且不溶于碱液中，只溶于强无机酸。几丁质具有强吸湿性，保湿效果亦相当好，并且具有吸附重金属离子的功能3. 几丁质酶的种类关于几丁质酶这一概念 目前用得 比较混乱 ，广义的几丁质 酶是指所有与几丁质降解有关的酶 ，还包括脱乙酰酶 ，壳聚糖 酶，几丁寡糖酶，几丁二糖酶等，狭义 的几 丁质酶是指催化水 解至少含有一个N.乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内 切酶和几丁外切酶， 其 中几丁外切酶又分为二亚类： 几丁二糖酶 从非还原端开始水解几丁微纤维释放N.乙酰萄糖胺二聚体 (GlcNAc)2，1，4BN 乙酰葡萄糖胺酶水解几丁寡糖或几丁二 糖释放N.乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)

5、单体.另外每一种酶都有一系 列同工酶，Sai to 曾在 St rep tomycescoelicolorA3(2)中分离出 7种几丁降解蛋白.Svital发现Vibrioharvey可诱导分泌至少 10种不同的几丁质酶几丁质酶根据其氨基酸序列特征可分成6类，工、II、W型归于糖基化水解酶的第19族，主要存在于植物中，工和W型在 与几丁结合有关的N端有一半胱氨酸的富集区，而II型缺乏这一 区，W的催化域与1、11的催化域相 比有二处氨基酸缺失.III、 V型归于第18族，广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢 动物、植物和哺乳动物中，其氨基酸序列与 19族缺乏同源性 .而 N乙酰葡萄糖胺酶被归

6、于第20族.绝大多数 的细菌性几丁质酶属于第 18家族，其主要功能是分 解周围环境中的几丁质 ，以满足其自身对营养的需求，而对真菌 的抑制能力较弱或无 ；这些酶具有多个功能区域，如催化部位、 几丁结合部位、纤维连接蛋白(ifbronectin) III区域及钙粘蛋白 (cadheifn)区域，但各区域的功能尚未被明确阐明.这些酶 对 allosamidin 敏感，催化部位有较多的.带状折叠 ，水解 GlcNAc.GlcNAc 和 GlcNAc.GlcN 键 ，水解产物保留异头构象 (anomericconfiguration) ，其催化机理可用基质辅助的催化模型 来解释。植物产生的几丁质酶大部

7、分为第 19族糖基化水解酶类，其功能 主要是抑制病原真菌的生长，进行 自我 防御 ，这类 酶对 allosamidin不敏感，催化部位有较高的a 一螺旋含量，水解 GlcNAcGlcNAc和GlcNGlcNAc键，水解产物无异头构象， 其催化机理常用酸碱模型来解释.Ohno首次发现属于原核微生物 的灰色链霉菌 StreptomycesgriseusHUT6037 能产生第19族的几 丁质酶 u ，此后还发现一些真菌及土壤 中的细菌也能产生具杀 真菌活性的 19族几丁质酶，这为生物防治及转几丁质酶基因植物 的构建带来了佳音。4. 几丁质酶的性质由于几丁质酶是一类复合酶 ，有多种蛋 白组成 ，各种

8、蛋白的性质有其 自身 的特点几丁质酶的分子质量一般在20120ku之间，其中细菌的几丁质酶多为60110ku,放线菌的多为 30ku或更低，真菌的一般大于 30ku，植物几丁质酶也在30ku 左右 ，昆虫 几 丁质 酶 的分 子 量 较 大，一 般 大 于 50ku.大多数细菌性几丁质酶有酸性的等电点，放线菌的一般为 中性或碱性，而植物的几丁质酶往往有非常酸性或非常碱性的 pl.大多数细菌性几丁质酶的最适pH为酸性或碱性，而放线菌和 真菌的最适pH常是酸性的J.关于几丁质酶 的热稳定性，一般 在60C以下稳定，但地衣芽抱杆菌的几丁质酶在IO0C处理10min后仍有一半多活性.WangSL发现一

9、种假单胞菌Pseudomon asaeruginosa KT87的胞外几丁酶F2有与地衣芽抱杆菌几丁质酶相似的热稳定性.值得注意的是近来Tanaka从嗜高热古细菌kodakaraensis K0D1中分离到了抗热性很强的几丁质降解酶，ChiA的最适作用温度是85C，在100C处理3min后 失活，但其缺失C端的同系物ChiAA2耐热性很强，在100 C处 理3h后仍保留70%的酶活力，这极大地拓展了几丁质酶的应用 范围.5. 表达几丁质酶的基因不同的微生物具有不同的几丁质酶基因，即使同一种微生物内 也会有不同的几丁质酶基因，这可能与生物进化过程 中几丁质酶 基因的获得方式有关.Techkamj

10、anaruk从海洋细菌 Pseudoalteromonasp . S91中分离到 5个几丁质降解基因 ll6J.Sai to 在一株链霉菌 St rep to mycescoelicolor 中分离到了 7个几丁质酶基因，其中5个为第18家族几丁质酶，2个为19 家族.18家族的基因变异幅度很大，在它们编码结构域和催化域 的核苷酸组成上显示出多样性.ChiE分子最大，从N端到C端依 次为：信号序列、几丁结合序列、串联重复的两个ifbronec tinIII型区域（这二个区域有50%的同源性）和一个催化区，ChiC与 ChiE相似，但缺少一个ifbronectin III型区域，ChiD只包含一

11、个 信号序列和一个催化区.它们之间氨基酸 的同源性为：C与D74%，D与E34%，C与E36%； C与E间的结合序列、III型区域 和催化区的核苷酸序列同源性分别为38%、43 %和36%，而A与B之间这三个区的同源性为 62%、50%和38%. ChiF、ChiG 为第19族，它们的序列高度保守，催化区序列间的同源性达 84， 即便与S. griseus的19族基因ChiC的催化区也有70%以上的 同源性.Watanabe认为这种高度保守的催化区与抗真菌活性有关1，但也有人认为这种几丁质酶之间的差异与产生该酶的细菌间 的进化距离有关.6. 几丁质酶的基因调节一般认为几丁质酶基因的调节 由抑制

12、子诱导子系统控制，几 丁质的降解产物如N 乙酰葡萄糖胺是较好的诱导物，而一些易 被利用的碳源如葡萄糖常是有效的抑制剂 .但 由于几丁质的存 在形式多样，因而不同诱导物诱导出的酶也各异，且几丁质酶常 以同功酶 的形式 分泌，经常相互有顺序地调节，构成了几丁质 酶 基 因 调 节 的 多 样 性 . Robert 等 曾 发 现 Trichodermaatroviride的NAGI基因可通过低分子量的几丁寡糖 和它本身的代谢产物诱导，而ECH42基因的表达似乎不被纯化的 几丁质或几丁寡糖直接诱导，但可被碳饥饿和一些胁迫条件 （2% 乙醇，低温等）所诱导_24. Techkarnjanaruk等也发

13、现几丁质酶 基因的启动子可通过饥饿或高 C07 水平来诱导，但不能被镉离 子，热冲击及紫外线所诱导. Ulhoa 认为几丁质酶诱导的信号可 能来 自于细胞表面与不溶性底物间的物理接触， 他们观察到几丁 质酶的诱导被8-羟基喹啉（一种RNA抑制剂）和放线菌酮（一种蛋 白质合成抑制剂）抑制 ，证明了此酶的诱导依赖于蛋白质的重新 转录和翻译。最近有报道说一种厌氧梭菌（ClostridiumparaputrficLtm)在以葡萄糖作为唯一碳源的培养基中其几丁质酶 操纵子也能低水平转录，Morimoto用免疫分析法在该菌的培养上 清液中检测到了几丁质酶的存在， Rivas 也发现枯草芽孢杆菌 168菌株

14、的CSN基因转录不被代谢物反馈抑制J,说 明这些几丁 质酶很可能是组成型的根据这些结果，有人推测一些微生物中 存在着组成型的几丁质酶,它们在正常条件下能低水平地表达, 一旦环境 中含有几丁质，就可将几丁质降解成N-乙酰葡萄糖胺的低聚物,继而由这些低聚物诱导出各种各样的几丁质酶 7几丁质酶的应用1) 几丁质酶对果疏采后病害防治的效果 果蔬采后由真菌引起的几种常见病害有青霉病、灰霉病、软腐 病、根霉病等，主要是由青霉菌(P. expansum)、灰葡萄抱 (Botrytis cinerea)、根霉菌(Rhizopus stolonifer)、疫霉 (Phytoph thora )等引起的。几丁质酶

15、作为一种重要的抗真菌酶， 应用于果蔬采后抗病害方面 ， 可显著地抑制真菌生长。目前已证 明几丁质酶对多种果蔬采后病害引起的腐烂具有显著的防治作 用。国外，Benhamou等在研究菜豆几丁质酶基因时，发现几丁质 酶对植物病原菌立枯丝核菌(Rhizoc tonia solani kuhn)有抑制作用;T abaeizadeh等研究番茄抗枯萎病时，发现几丁酶能有效 地抵御这类真菌对番茄的感染 ; Anton io Ippolito 等对苹果的 采后贮藏期间腐烂情况进行观察时 ，发现灰霉病菌和青霉病菌这 两种真菌会感染苹果的组织 ，从而诱导苹果的几丁质酶进行抗病 反应；Maryline等发现,几丁质酶

16、对葡萄的病原菌灰葡萄抱霉有 生物防治作用。国内 ,马桂珍等研究发现,链孢粘帚霉几丁质酶除 对小麦雪腐病、葡萄白腐病、玉米黄斑病及斑点落叶病等病原菌 的抱子萌发具有明显的抑制作用外 ,还能明显抑制核盘菌和立枯 丝核菌的菌核萌发;王勇等在研究绿色木霉菌株 Tr9701（Trichoderm aviride） 对黄瓜立枯病和番茄灰霉病的生物 防治机理时，发现绿色木霉菌Tr9701产生几丁质酶，且经诱导处 理酶产量明显提高, 其酶粗提液对立枯病菌、灰霉病菌有显著抑 制作用; 曲明静等用网斑病菌和黄曲霉菌对 17 个花生品种室内 接种研究花生网斑病菌和黄曲霉菌对花生几丁质酶诱导作用时 ， 发现花生几丁质酶是与花生抗网斑病、黄曲霉病密切相关的一种 抗性相关蛋白。2）真菌几丁质合