一、实验目的与要求1. 掌握 SDS-PAGE 电泳的操作步骤2. 学会用电泳图分析原核表达效果二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的 不同就可以分开蛋白质该技术最初由 shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和丙烯 酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基磺酸钠)后，蛋白质亚基的电泳 迁移率主要取决于亚基分子量的大小三、 实验材料与试剂诱导表达后的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳试剂，蛋白上样缓冲液等四、 实验仪器设备伯乐蛋白电泳仪，细菌振荡培养箱、高压灭菌锅、电子天平，电炉，量筒等五、实验步骤1、 SDS-PAGE凝胶电泳试剂1) 1.0 M Tris/HCl溶液(pH 6.8)： 121 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HC1 调pH至6.8，定 容至1 L；2) 1.5 M Tris/HC 1 溶液(pH 8.8)： 182 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HCl调pH至8.8,定 容至1 L；3) 30 %丙烯酰胺溶液：292 g丙烯酰胺和8 g甲叉双丙烯酰胺溶于900 mL蒸馏水中，定 容至1 L，4 €避光贮存待用；4) 5x电泳缓冲液(pH 8.3)： 94 g甘氨酸和15.1 g Tris溶于800 mL蒸馏水中后，加入50 mL10 % SDS溶液，定容至1L,常温贮存，用时用蒸馏水稀释至1倍缓冲液；5) 上样缓冲液：4 mL 10 % SDS溶液，0.2 mL巯基乙醇，1 mL 1.0 M Tris缓冲液，然后 加入2 g甘油，20 mg溴酚蓝，充分溶解后定容到20 mL，4 °C贮存待用；6) 染色液：1.0 g考马斯亮蓝(R250)，100 mL冰醋酸，450 mL甲醇混合，定容至1 L， 充分混匀备用；7) 脱色液：乙酸100 mL,甲醇300 mL,加水定容到1 L；8) 10 %过硫酸铵： 0.1 g 过硫酸铵加入1 mL 蒸馏水充分溶解，需现配现用。
2、 SDS-PAGE凝胶电泳试剂1) 利用12 %的分离胶进行SDS-PAGE进行电泳2) 配制12 %的分离胶(10 mL)8.0 jiLp1.5 MTrisZHCl (pH8.8) q | 2.5 mLp北％丙烯酰胺溶液卫4.0ddH2O 心3.310 % SDS^0.1 mLp10%过硫酸钱卫IITEMEDq混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入分离胶溶液，留出浓缩胶的空间（与顶部距离约2.5 cm）,以无水乙醇封胶，室温放置使其完全聚合（约30 min）4）倒掉无水乙醇，超净工作台放置10-15 min,使其完全挥发;&05） 5 %浓缩胶配制（10 mL）| 30 %丙烯醜胺溶液卫 | 1.7 町I •IMTrisZHCl (pH6.8)10%过硫酸按卫0.1 ml>ITEMEDqddH2O 心I10 % SDS+II6.8 ml>! 0.1 mL*1混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入浓缩胶溶液至顶端，小心插入梳子，室温放置 使其完全聚合（约30 min）6）聚合完全后，轻轻拔出梳子，放入电泳设备，准备点样；7） 点样：用点样10吐枪头进行点样，每次点20吐；8） 电泳：额定电压80 V 30-60 min，待溴酚蓝条带离开浓缩胶时调整额定电压为120 V 至电泳结束；9） 染色及脱色：SDS-PAGE电泳结束后，小心取出凝胶，用去离子水清洗3-4遍，加入 染色液染色2-3 h（30 r/min），倒掉染色液，用去离子水漂洗3-4遍，加入脱水液脱色6-8 h ；10） 成像：脱色结束后用Bio-rad成像系统成像拍照并保存图片。
六、实验作业1、 简述SDS-PAGE操作原理2、 简述SDS-PAGE操作步骤3、 何谓聚丙烯酰胺凝胶电泳？4、 何谓电泳及其分离原理？5、 SDS-PAGE的应用有哪些？6、电泳蛋白样品如何制备？。