第七章 海洋藻类 Crypthecodinium cobnii异养生长生产二十二碳六烯酸可用的替代碳源前言近年来，多不饱和脂肪酸备受关注，这是因为它们在人体中的有着各种生理功能， 且有益人类健康至今，鱼油是主要的脂肪酸；一些海洋微藻种的单细胞油脂（SCO） 也含有重要的多不饱和脂肪酸在本书的各章节中，这些油是主要的脂肪酸来源重要的异养海洋生物甲藻，Crypthecodinium cobnii，相关研究很多这仅是多不 饱和脂肪酸的一类单细胞油脂DHA, C.cobnii中积聚了高含量的DHA［脂肪酸总量的 25-60%］优化 DHA 生产的重要参数，包括生长率、初始生物量、总脂含量以及脂 类中DHA比例大部分商业化的培养过程中，葡萄糖是主要的碳源和能源葡萄糖 是工业生产中容易获得的原料，从谷物淀粉中通过水解（化学、酶解）得到葡萄糖浆 成本低、获取方便、能浓缩储存，以溶液灭菌，性质稳定制成水溶液便于发酵，且 灭菌容易，传输到最终的发酵罐中是单一的溶液但它不可能仅满足作为底物的条件 这一章讨论了利用替代碳源-乙酸和乙醇-生长，脂类积聚， DHA 生产， C.cobnii 批 量分批补料式培养培养。
通常也将葡萄糖作为可用的原料乙酸在石化工业中生产的比例很大，其成本是葡萄糖的三倍，大约600美元/t 发酵中大比例使用有缺陷，以浓缩的方式，要求操作小心，任何溢出物或接触到皮肤 必须迅速处理将其归类为“强酸”，它没有盐酸或硝酸这些无机酸攻击性强因此， 大量使用时不需要紧急警告乙醇能通过发酵生产，在巴西、新西兰、美国广泛生产，被视为“汽油醇”因为 是用葡萄糖发酵生产，其成本高于葡萄糖食品级”乙醇，需要满足“食品级”DHA 生产，售价760-800美元/t，现在比乙酸更贵这些底物，如葡萄糖，是水溶液，因此混在发酵媒介中没有问题这些底物都是 “纯品”，作为人类消费品生产也是适当的他们没有残留，没有未发酵的化合物，最 终的废物可以最小限度处理分批补料式培养培养中 ，这些底物都可使用，其优点 是可以自身消毒，减少污染的风险使用替代碳源用乙酸或乙醇作为发酵分批补料式培养替代葡萄糖，总体来看在改进生产上减少 了成本如果使用替代分批补料式培养，产量提高，附加产物回收的优点，或改进发 酵蒸汽产生的废弃物处理方法，可以额外鼓励转换底物这样来看，替代分批补料式 培养的优点和缺点与原料生产成本没有太大的相关性。
在以乙酸和乙醇为底物时，不像葡萄糖，可以马上注意到，这些原料浓度高出1-2% 对大部分细胞是有毒的在发酵过程中使用很少的碳底物是不实际的（最终细胞生物 量得率不能超过5g/L）这个过程中，附加的底物供给到发酵罐，保持底物浓度在 限制生长的浓度之下现在的问题是如何达到附加的浓度，另外，不能超过限制生长 的浓度的可以用下面的行动表明，这不是不能控制的任务事实上，大部分工业化 发酵过程使用分批补料式培养工艺模型来优化生产，这就表示可以在许多引用单元中 使用乙酸和乙醇作为底物使用乙酸当浓度超过5-10g/L时，乙酸对许多微藻有毒，少量的有机体，能在高于20g/L， 甚至在中性条件下时生长 Vazhappily 和 Chen 就乙酸对于 C.cobnii 及其他微藻的毒 性做了一些初步研究，研究表明 C.cobnii 能在浓度不超过 1g/L 的醋酸盐中生长；因 为培养基质中有其他碳源，结果不完全清楚一些初步的实验室研究表明 C.cobnii 能 在3g/L的乙酸钠中生长，但生长对pH要求严格这些问题在使用乙酸作为分批补料 式培养时都是很关键的当添加到发酵基质中，乙酸被中和或带进平衡离子，通常是Na+或K+。
当细胞生 长时，乙酸盐（CH3CO0-）消耗，被氢氧离子（0H-）取代，结果导致pH升高事 实上，NaOH是乙酸盐的消耗产物这件快速增长pH值，制止细胞生长如果要避 免 pH 值的风险，必须用酸滴定的方法；有没有比乙酸更好的酸？乙酸的容器附在发 酵罐上并带有pH计和剂量泵这些设备能按需要将乙酸加到发酵基质中在初步研究中，不管C.cobnii在乙酸盐中的不确定生长，乙酸盐能用作碳源和pH 连续文化设备，一个适当可行的评估系统，用于生产富集DHA的单细胞油脂最佳 的生产率是初始浓度达到8g乙酸盐/L（图7.1）细胞的脂类含量只有微小变化（45-50% 生物量），初始乙酸盐浓度达到12g/L，油中DHA含量没有实际的变化（40-50%）5Q 75 IM 135 I 初7zn»-；h)图7.1 (A)生长率，(B)细胞中脂类含量，(C) DHA在脂肪酸总量中含量C・cobni在pH6・5，连续文化设备下的乙酸钠中培养ao200dOOB40X-10070606015a10201CQ100200300Tirn#(DJ300■Rmeth；Trna(h)图7.2纯乙酸分批补料式培养培养C. cobnii培养基：10g/L酵母提取物/L,25g 海盐/L,8gNaAc/L;10%（V/V）接种物。
A）添加乙酸的生物量干重（DW） ;（B） 干基中脂类含量，脂类中DHA含量；（C）脂类含量，DHA （%四）生产力总 容量和DHA浓度表 7.A C.cobnii ATCC30772 在葡萄糖和 pH 连续文化设备下培养，总脂质和中性脂质的脂肪酸分布（%w/w）占try AddGlucosg'GrownAcetk Acid-GrownTotal LipicfNeutral Lipfds3Total LipidNeutral Lipids^KhO77tr.btr.W241978啦2622211616,089181616;11222*8^)1218:1911W22^ {DHA)e26313947^Represents 74-75% of the total lipid in each case.*v = <0.5%DHA, Docos^hexaenok AcidSource Ratledge et 礼 2001）总体而言，这个系统的结果优于使用葡萄糖作原料的生长率提高60%，细胞 脂质增加70%, TFA中DHA增长50% （表7.A）这些增长表明在这些细胞的 TAG 碎片中， DHA 的水平更高。
作者解释使用乙酸盐改进 C.cobni，i 与葡萄糖 相比,至少部分是由于它总是在最大可能的速度增长AcetateEthanalAtoni、 * ~~NADAcetatf ■OUTSILJL[NSiOiTAn«tyl-CaARiospfioenolpyTuvaEaMaf^e/pyruvtifvJCL K这一发现被Swaaf等证实，他们采用长期培养（达400h）细胞生物量回收率 为109g/L（图7.2）然而，这种高密度培养所需的混和物，以维持充足的有氧条件, 这种氧气进入系统的传递是由复杂培养粘度增加，这种粘度增加是对胞外多糖生 产的结果工业上生产DHA，培养一个商业化的多糖水解酶制剂，能降低粘度 需要保持一个固定的溶解氧浓度，才能降低搅拌速度图 7.3 C.cobnii 在乙酸和乙醇中可能的 DHA 生物合成途径C.cobnii 含量低的其他原因可能是培养时分泌了琥珀酸，作者没有注意到在 乙酸盐pH连续文化设备控制下，发酵罐中乙酸盐浓度没有与时间一致，实际上， 从8g乙酸盐/L到lg/L阶段性递减，不管新加入的乙酸浓度这种下降表明，有 一成的一些细胞外代谢产物乙酸，已证实是聚丁二酸高达 5 克/ L 的，这种积累 是由于一个限速步骤存在，作为三羧酸循环的一部分转化琥珀酸酸富马酸（图 7.3）。
它加剧了醋酸细胞生长，其中有两条路线现在生产琥珀酸：一个来自异柠 檬酸裂合酶以及 2-酮戊二酸之一解决方法是积累琥珀酸（这显然是醋酸的浪费，至少部分的醋酸生物产量 低），添加1%（v / V）丙酸到介质图7.4显示了在这些条件下的生物性能的提 高底物生物量增加到约50g/L,总脂达到60%的细胞生物量DHA含量在脂类 中依然保持适当的 35-40%（表 7.B）与预料的相反，增加丙酸盐剂量在脂类中不适用于奇数链长的脂肪酸（表 7.B）增加的丙酸盐用于用于细胞代谢等其他方面，这可以明显改善碳源乙醇考虑作为生产单细胞油脂的有潜力的原料，在 70年代和80年代在捷克、俄罗斯、日本，在工作中采用用了一些特别的油脂性的酵母在这些研究中， Yamauchi 等用计算机控制，批量分批补料式培养发酵这一技术对细胞密度有要 求：153g/L超过140h，细胞油脂含量超过50%C.cobnii生产DHA，作者之前鉴定以培养比例和生产容量作主要因素，在过 程中是可行的明显的，DHA含量高，生物量也高，这在产品回收时也描述了以实验室的比例培养， C.cobnii ATCC30772 中 rDHA 报道的葡萄糖是 19mgL-1h-1，用葡萄糖（50%w/v）分批补料式培养生产，生产力相似。
以乙酸作为 碳源，在pH连续文化设备控制下批量培养，获得48mg DHA h-1L-1产量（图7.2 和图7.4）这一发现表明用C.cobnii生产DHA，碳源影响很大和乙酸类似，乙醇也是C.cobnii的潜在碳源，经证实其对细胞无毒，能进入 细胞并引发代谢乙醇的利用表明醇脱氢酶的存在，转换乙醇为乙醛，乙醛脱氢 酶将转换乙醛为醋酸（图 7.3）作为一个大面积种植碳源，乙醇可能比醋酸有 优势，因为它能够产生较高的生物量特别是乙醇的易燃性质-具体要求储存及大 规模应用此外，乙醇作为发酵原料，需要设备以及另外一个控制系统，在生物 反应器中控制适度的酒精浓度C.cobnii对乙醇的利用在最初的摇瓶培养中进行 了研究藻类生长在一个复杂培养基中，含有酵母提取物，海盐和变化的乙醇浓 度酵母提取物作为单一碳源中是可忽略的5g/L或10g/L浓度下，细胞生长良 好（图7.5）在这些乙醇浓度下，用生长曲线的指数来计算生长率与5g乙醇 /L培养对比，10g乙醇/L下，显示有一个明显的延长期乙醇浓度为15g /L或更 高时， C.cobnii 生长实际上减弱了这些数据表明乙醇和乙酸一样，不能直接用 于分批培养以达到高的生物量浓度。
jhd IH1 "1 -jJQEV PHJ<11 求w_i图 7.4 C.cobniiATCC 30772 在 pH 连续文化设备下培养，乙酸作分批补料式培养，10g/L图7.5初始乙醇浓度对C.cobnii摇瓶培养生长的影响培养基：2g/L酵母提取 物；25g海盐/L;10% （V/V）接种物乙醇以0、5、10、15、25g/L浓度添加进 培养基中吸光度（OD）值相对1g/L的细胞干重为1为了避免毒性，供给充足的能量，生长和代谢活力，de Swaaf等在一个2L 的计算机控制的实验室生物反应器中改进了乙醇分批补料式培养工艺脂类生产 要求提供充足的氧气，溶解氧浓度（DOT）保持超过30%的空气饱和度这一目 标可以通过控制搅拌速度（范围：200-1250rpm），通过滤法消毒的空气来实现初始培养基中含乙醇 5.5g/ L 开始接种相对于前面介绍的乙酸的过程，乙 醇还有一点是不能 通过改变 pH 值来控制因此，作者根据溶解氧浓度改进了乙醇自动补料系统， 这个系统中增加了一个灭菌的乙醇传感器，结果也和。