《2021鲑鱼甲病毒病检疫技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2021鲑鱼甲病毒病检疫技术（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、鲑鱼甲病毒病检疫技术规范鲑鱼甲病毒病检疫技术规范1 范围本标准规定了鲑鱼甲病毒组织病理、病毒分离、逆转录聚合酶链反应、实时荧光逆转录聚合酶链反应、间接免疫荧光的检测方法。本标准适用于鲑鱼甲病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088出入境动物检疫采样3 缩略语下列缩略语延用于本文件。CHSE-214 ：大鳞大麻哈鱼胚胎细胞（Chinook salmon embr
2、yo-214） CPE ：细胞病变（Cytopathic effect）Ct ：达到阈值的循环数（Cycle threshold）dATP ：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（Deoxyadenosine triphosphate） dCTP ：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（Deoxycytidine triphosphate） DEPC ：焦碳酸乙二酯（Diethypyrocarbonate）dGTP ：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（Deoxyguanosine triphosphate） dNTPs ：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleotide triphosphates）dTTP ：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核
3、苷酸（Deoxythymidine triphosphate） EB ：溴化乙锭（Ethidium bromide）EDTA ：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminete traacetic acid） FITC ：异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate）HEPES ：4- 羟乙基呱嗪乙硫磺酸（4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhanesulfonic acid） IFAT ：间接免疫荧光（Indirect fluorescent antibody test）IPNV ：传染性胰腺坏死病毒（Infectious pancr
4、eatic necrosis virus） RNA ：核糖核酸（Ribonucleic acid）RNase ：酶（Ribonuclease，RNA）RT-PCR ：逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction） SAV ：鲑鱼甲病毒（Salmonid alphavirus）4 疾病概述鲑鱼甲病毒病主要感染鲑科鱼类，该病病原鲑鱼甲病毒（SAV），属于披膜病毒科（Togaviridae）11甲病毒属（Alphavirus），其基因组为线性单股正链 RNA。参见附录 A。5 试剂和材料5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级
5、水的规格，用 DEPC 处理以除掉 RNA 酶。5.2 SAV 病毒参考株，抗 SAV 抗体，由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。5.3 10% 甲醛。5.4 乙醇：70%、80%、95% 及无水乙醇。5.5 二甲苯。5.6 石蜡。5.7 苏木精染液。5.8 0.5% 伊红乙醇溶液。5.9 中性树脂。5.10 孵育液（见附录 B 中 B.1）。5.11 细胞培养液（见附录 B 中 B.2）。5.12 CHSE-214 细胞系：用细胞培养液 20 培养。5.13 逆转录酶：20 U/L，-20 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.14 RNase 抑制剂：20 U/L，-20 保存，不要
6、反复冻融或温度剧烈变化。5.15 Trizol 试剂：RNA 抽提试剂，4 保存。5.16 Taq 酶：5 U/L，-20 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.17 dNTPs: 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。5.18 RT-PCR 引物的序列如下：E2F: 5-CCG-TTG-CGG-CCA-CAC-TGG-ATG-3 E2R: 5-CCT-CAT-AGG-TGA-TCG-ACG-GCA-G-3扩增糖蛋白 E2 基因 516 bp 的片段（参见附录 C）。引物浓度为 40 moL/L。5.19 实时荧光 RT-PCR 的引物和探针的序列如下： QnsP
7、1F: 5-CCG-GCC-CTG-AAC-CAG-TT-3 QnsP1R: 5-GTA-GCC-AAG-TGG-GAG-AAA-GCT-3探针 : 5-FAM-CTG-GCC-ACC-ACT-TCG-A-BHQ1-3扩增非结构蛋白 nsP1 基因 107 bp 的片段。引物浓度为 40 moL/L，探针浓度为 10 moL/L。5.20 75% 乙醇：用无水乙醇和 DEPC 水配制，使用前预冷到 -20 。5.21 三氯甲烷：4 保存。5.22 异丙醇：4 保存。5.23 DNA 相对分子质量标准：分子量大小 100 bp2 000 bp 间的 DNA 片段，-20 保存。6 器材和设备6.
8、1 包埋机。6.2 切片机。6.3 96 孔细胞培养板。6.4 倒置显微镜。6.5 荧光显微镜。6.6 恒温培养箱。6.7 普通冰箱和超低温冰箱。6.8 组织研磨器（处理方法参见附录 D）。6.9 离心机和离心管（处理方法参见附录 D）。6.10 PCR 扩增仪。6.11 荧光 PCR 扩增仪。6.12 水平电泳仪。6.13 微量移液器及吸头（处理方法参见附录 D）。6.14 凝胶成像仪。6.15 制冰机。7 临床症状一般表现为食欲减退，体型瘦长，昏睡，眼突，腹水以及出现粪便拖尾，无法保持在水中的位置，螺旋或绕圈地游动，或者在水底不动。病鱼心脏苍白，肠道空虚、有黄色黏液，体内脂肪很少， 有时在
9、幽门、盲肠和四周的脂肪出现瘀斑出血。8 组织病理8.1 操作步骤取鱼的胰腺、心肌、骨骼肌，用 10% 甲醛（5.3）固定至少 24 h。固定好的组织按照常规石蜡切片方法制作切片，用苏木精 - 伊红（H & E）染色后封片，显微镜下观察。8.2 结果判定8.2.1 典型组织病理病变为胰腺外分泌组织丧失，心肌、骨骼肌坏死和炎症。8.2.2 检测样品中观察到典型病变，判定为阳性。8.2.3 检测样品中没有观察到典型病变，判定为阴性。9 病毒分离9.1 样品采集取样数量按 GB/T 18088 的规定执行，优先选取具有临床症状的个体，宜每 5 尾鱼一个小样。若有症状的鱼每 1 尾作为一个小样，体长 4
10、 cm 的鱼苗取整条鱼，但如有卵黄囊需除去；体长 4 cm6 cm 的鱼苗取所有内脏和鳃；体长 6 cm 的鱼取鳃、心、肾。用于组织病理检查的，取胰、心肌、骨骼肌。9.2 样品处理对组织称重后，用组织研磨器制备组织匀浆，用孵育液（5.10）制备 2% 的组织悬液。于 15 孵育 4 h，或 4 孵育过夜。4 000 g 离心 15 min，收集上清液。9.3 病毒分离用孵育液（5.10）对 2% 组织匀浆上清液作两次 10 倍稀释，将 3 个稀释度的上清液分别接种到生长 24 h 以内的 CHSE-214 细胞单层中，每孔（2 cm2）最多接种 100 L。15 吸附 2 h3 h 后，吸去稀
11、释液，加入细胞培养液（5.11），置于 15 培养。同时设置阳性对照和阴性对照。当样品来自 IPNV 的流行区，在接毒之前需将稀释液与适当浓度抗 IPNV 血清（中和效价不低于2000）等量混合，15 孵育 1 h。14 d 内每天用倒置显微镜观察。如果接种了待检匀浆悬液的细胞中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有 CPE 出现，则在培养 14 d 后用 CHSE-214 细胞进行盲传。传代时，将接种了组织匀浆悬液的细胞单层培养物冻融 12 次，以 3 000 g、4 离心 5 min，收集上清液，按 1 : 5 稀释，按照上文方法接到新的细胞中，每天用倒置显微镜
12、检查。9.4 结果判定9.4.1 SAV 引起的 CPE 典型现象为出现核固缩、有空泡细胞的斑块，见附录 A 图 A.1。9.4.2 若阳性对照出现 CPE，而阴性对照未观察到 CPE，实验有效。9.4.3 若检测样品首次接种细胞或盲传后细胞出现典型 CPE，判定为阳性。9.4.4 若检测样品盲传后细胞仍未观察到 CPE，判定为阴性。10 间接免疫荧光10.1 操作步骤细胞接种病毒，于 15 培养 9 d11 d 后，去除细胞培养液，用 80% 丙酮洗涤一次，然后再加入 80% 丙酮，室温固定 20 min。去除 80% 丙酮，室温晾干 1 h（固定的细胞可以在 4 中储存 14 d）。加入用
13、 PBS 梯度稀释后的抗 SAV 抗体，室温孵育 1 h。用 PBS（含 0.05% 吐温 -20）洗涤 3 次。加入FITC 偶联抗鼠二抗，室温孵育 1 h。用 PBS（含 0.05% 吐温 -20）洗涤 3 次，PBS 洗涤 1 次，在紫外光下观察。染色的样品应尽量避光。同时设置阳性对照和阴性对照。10.2 结果判定10.2.1 特异荧光为细胞质内的绿色荧光，见附录 A 图 A.2。10.2.2 若阳性对照观察到特异荧光，而阴性对照未观察到特异荧光，实验有效。10.2.3 检测样品中观察到特异荧光，判定为阳性。10.2.4 检测样品中没有观察到特异荧光，判定为阴性。11 RT-PCR11.
14、1 RNA 抽提将出现 CPE 或培养 14 d 的细胞培养物冻融 3 次，以 3 000 g、4 离心 5 min，取 200 uL 上清加入到 1.5 mL 离心管。或取匀浆成糊状的组织样品 25 mg100 mg 加入到 1.5 mL 离心管。加入 1 mLTrizol，用枪头充分吹打均匀；加入 200 L 三氯甲烷（5.21），涡旋振荡 30 s ；12 000 g 离心 15 min ；取上层水相到新的 1.5 mL 离心管，加入 500 L 异丙醇（5.22），上下颠倒数次混匀，静置 10 min ； 12 000 g 离心 15 min ；弃上清，沉淀物用 1 mL DEPC 水
15、配制的 75% 乙醇（5.20）洗涤；8 000 g 离心10 min ；弃上清，沉淀室温干燥 10 min ；加入 30 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。提取后的 RNA 应尽快用于逆转录合成 cDNA 模板。具备同样抽提效率的商业化 RNA 抽提试剂盒也同样适用。11.2 cDNA 模板制备取 18.5 L RNA 溶液，加 10 倍逆转录酶浓缩缓冲液（见附录 B 中 B.3）2.5 L、dNTP 1 L、RNA 酶抑制剂 1 L、逆转录酶 1 L、下游引物 1 L。混匀后，置 PCR 仪上 50 反应 30 min，95 反应10 min，-20 保存。11.3 PCR在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液（见附录 B 中 B.4）2.5 L、dNTPs 0.5 L、Taq 酶 0.5 L、上游引物和下游引物各 0.
