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1、 本章主要学习内容和要求本章主要学习内容和要求本章主要学习内容和要求本章主要学习内容和要求主要学习内容主要学习内容主要学习内容主要学习内容要求要求要求要求miRNAmiRNAmiRNAmiRNA概念与特点概念与特点概念与特点概念与特点 常用常用常用常用miRNAmiRNAmiRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法检测与定量的方法检测与定量的方法 掌握掌握掌握掌握第二十一章第二十一章 microRNAmicroRNA检测技术在临床的应用检测技术在临床的应用miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能 miRNAmiRNA检测在肿瘤诊断中的应用检测在肿瘤诊断中的应用 熟悉熟悉熟悉熟悉
2、了解了解了解了解miRNAmiRNAmiRNAmiRNA检测在神经系统疾病诊断中应用检测在神经系统疾病诊断中应用检测在神经系统疾病诊断中应用检测在神经系统疾病诊断中应用 miRNAmiRNAmiRNAmiRNA检测在心血管系统疾病诊断中应用检测在心血管系统疾病诊断中应用检测在心血管系统疾病诊断中应用检测在心血管系统疾病诊断中应用 上一页上一页下一页下一页返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述一、一、一、一、miRNAmiRNAmiRNAmiRNA概念与特点概念与特点概念与特点概念与特点 (一一一一)miRNAmiRNAmiRNAmiRNA概念概念概念概念miRNA是一类进化上保守的
3、单链非编码小分子是一类进化上保守的单链非编码小分子RNA，定位于定位于RNA前体的前体的3端或端或5端，具有在翻译水平调控基因表端，具有在翻译水平调控基因表达的功能。达的功能。上一页上一页下一页下一页返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述 一、一、miRNAmiRNA概念与特点概念与特点（二）（二）miRNAmiRNA基本特征基本特征 1.1.结构特征结构特征 2.2.miRNAmiRNA的存在形式的存在形式 3.3.保守性保守性 4.4.时空特异性时空特异性 上一页上一页下一页下一页返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述 一、一、一、一、miRNAmiRNAmiRNA
4、miRNA概念与特点概念与特点概念与特点概念与特点（三）不同生物的（三）不同生物的miRNAmiRNA特点特点 植物与动物植物与动物miRNAmiRNA的区别的区别 上一页上一页下一页下一页动物动物植物植物前体茎环结构前体茎环结构短，简单短，简单长，复杂，折回长度变长，复杂，折回长度变异明显异明显加工过程加工过程先在细胞核内，后再细先在细胞核内，后再细胞质胞质仅在细胞核内仅在细胞核内作用机制作用机制大部分作为翻译阻遏子，大部分作为翻译阻遏子，小部分导致靶小部分导致靶mRNAsmRNAs的的降解降解大部分介导靶大部分介导靶mRNAsmRNAs的的降解降解长度长度21-23nt21-23nt21n
5、t21nt保守性保守性高高更高更高返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述 一、一、一、一、miRNAmiRNAmiRNAmiRNA概念与特点概念与特点概念与特点概念与特点（四）（四）miRNAmiRNA与与siRNAsiRNA的比较的比较 1.miRNA1.miRNA与与siRNAsiRNA相同之处相同之处 （1 1）二者的长度都约在）二者的长度都约在22nt22nt左右。左右。（2 2）二者都依赖）二者都依赖DicerDicer酶的加工，是酶的加工，是DicerDicer的产物，所以的产物，所以具有具有DicerDicer产物的特点产物的特点:5:5端磷酸，端磷酸，3 3端均有端
6、均有2 2个游离核个游离核苷酸。苷酸。（3 3）miRNAmiRNA和和siRNAsiRNA合成都是由双链的合成都是由双链的RNARNA或或RNARNA前体形成前体形成的。的。（4 4）二者都是）二者都是RNARNA诱导的基因沉默复合体诱导的基因沉默复合体 (RNA induced(RNA induced silencing complexsilencing complex，RISC)RISC)组分，都具有组成组分，都具有组成RISCRISC复合体复合体的的ArgonauteArgonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。
7、者在介导沉默机制上有重叠。上一页上一页下一页下一页返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述 一、一、一、一、miRNAmiRNAmiRNAmiRNA概念与特点概念与特点概念与特点概念与特点（四）（四）miRNAmiRNA与与siRNAsiRNA的比较的比较 2.miRNA2.miRNA和和siRNAsiRNA区别：区别：（1 1）根本区别是）根本区别是miRNAmiRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；是内源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNAsiRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断
8、，病毒基因组转录片断等，。断和转座片断，病毒基因组转录片断等，。（2 2）二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链）二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNARNA，miRNAmiRNA转录转录出来时必然是发夹状的，出来时必然是发夹状的，siRNAsiRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。可以从发夹来。（3 3）本质区别在于作用位点上，）本质区别在于作用位点上，miRNAmiRNA作用于固定的靶基因，有特定作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因的作用位点，一般在靶基因3-UTR3-UTR区，而区，而siRNAsiRNA由于是随机产生
9、的或由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNAmRNA的任何的任何部位。部位。（4 4）在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互）在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，补程度，siRNAsiRNA也可抑制靶标基因的翻译。也可抑制靶标基因的翻译。（5 5）miRNAmiRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因表达，而表达，而siRNAsiRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是生物抵抗外来核酸片断
10、入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。是抑制转座子活性和病毒感染。上一页上一页下一页下一页返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（一）（一）miRNAmiRNA生物合成生物合成上一页上一页下一页下一页1 1 miRNAmiRNA生物合成过程生物合成过程 在细胞核内，基因组在细胞核内，基因组DNA DNA 转录生成较长的转录生成较长的RNARNA分子（可长分子（可长达达1000nt1000nt），被双链），被双链RNA RNA 特异的核糖核酸酶特异的核糖核酸酶 DroshaDrosha 切割成切割成长度大约长度大约
11、70-100 70-100 碱基的、具发夹结构的碱基的、具发夹结构的RNA RNA 分子（前体分子（前体 microRNAmicroRNA）。这些发夹结构的）。这些发夹结构的RNA RNA 通过核输出蛋白通过核输出蛋白exportin5 exportin5 机制转运到细胞质，然后被第二个双链机制转运到细胞质，然后被第二个双链 RNA RNA 特异的核糖核酸特异的核糖核酸酶酶Dicer Dicer 切割，得到切割，得到19-23nt 19-23nt 大小的成熟的大小的成熟的miRNAsmiRNAs 产物。产物。返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述二、二、miRNAmiRNA生物合成
12、与功能生物合成与功能（一）（一）miRNAmiRNA生物合成生物合成上一页上一页下一页下一页 miRNAmiRNA生物合成过程生物合成过程 返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（一）（一）miRNAmiRNA生物合成生物合成上一页上一页下一页下一页2 2 miRNAmiRNA在基因组分布在基因组分布独立表达的独立表达的miRNAs成簇表达的成簇表达的miRNAs位于内含子的位于内含子的miRNAs返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（二）（二）miRNAm
13、iRNA 生物学功能生物学功能1.miRNA1.miRNA调控基因表达机制调控基因表达机制 上一页上一页下一页下一页miRNAmiRNA调控基因表达两种机制调控基因表达两种机制 miRNAmiRNA调控蛋白翻译调控蛋白翻译 miRNAmiRNA调控调控mRNAmRNA降解降解返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（二）（二）miRNAmiRNA 生物学功能生物学功能 2.2.miRNAmiRNA调控基因表达的特征与优点调控基因表达的特征与优点（1 1）miRNAmiRNA调控基因表达的特点调控基因表达的特点 1）交叉调节;2）
14、自我调节;3）可逆性调节.（2 2）miRNAmiRNA调控基因表达的优点调控基因表达的优点 1）与蛋白水平的调节相比，更加节省能量 2）与转录水平调节相比，miRNA 调节更迅速，而且是可逆的 3）内含子所编码的 miRNA 是一种对基因组资源的高效利用上一页上一页下一页下一页返回返回第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述三三miRNAmiRNA应用应用（一）基因功能的分析（一）基因功能的分析（二）（二）miRNAmiRNA 功能和效应的评价功能和效应的评价（三）（三）新型基因治疗方案的设计和发展新型基因治疗方案的设计和发展（四）抗病毒疫苗的设计和研制（四）抗病毒疫苗的设计和研制（五）功
15、能缺失转基因动物的建立（五）功能缺失转基因动物的建立上一页上一页下一页下一页返回返回第二节第二节第二节第二节 miRNAmiRNAmiRNAmiRNA检测与定量方法检测与定量方法检测与定量方法检测与定量方法一、理想的一、理想的miRNAmiRNA检测与定量方法检测与定量方法miRNAmiRNA检测检测 1.1.具有足够的灵敏性检测到少量的具有足够的灵敏性检测到少量的miRNAmiRNA；2.2.具有足够的特异性足以分辨一个碱基差异的具有足够的特异性足以分辨一个碱基差异的 miRNAmiRNA；3.3.能够进行能够进行miRNAmiRNA表达的定量分析；表达的定量分析；4.4.进行多样本平行检测
16、；检测过程简便、经济。进行多样本平行检测；检测过程简便、经济。上一页上一页下一页下一页返回返回第二节第二节第二节第二节 miRNAmiRNAmiRNAmiRNA检测与定量方法检测与定量方法检测与定量方法检测与定量方法 二、几种常用二、几种常用miRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法（一）基因芯片技术（一）基因芯片技术miRNAmiRNA microarraymicroarray可可以以检检测测组组织织特特异异的的miRNAmiRNA,并并且且实实验验结结果果可可重重复复率率高高。这这种种微微芯芯片片不不仅仅可可以以检检测测miRNAmiRNA的的类类型型,还还可可以以对对其其进进行行定定量量。它它可可以以一一次次在在同同一一样样本本中中检检测测出出几几百百个个基基因因的的全全部部表表达达;通通过过设设计计适适当当的的寡寡核核苷苷酸酸探探针针,同同时时检检测测成成熟熟的的miRNAmiRNA及及其其前前体体分分子子;miRNAmiRNA microarraymicroarray可可以以用用于于高高通通量量的的筛筛选选miRNAmiRNA,并并且且可可以以用用于于临临床床病病例
