《多基因共表达载体的构建策略》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多基因共表达载体的构建策略（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、多基因共表达载体的应用l l表达异源多聚体蛋白的亚单位，如免疫球蛋白、细胞受体、白细胞介素、转录因子等l l同时表达针对同一靶细胞的几种异源蛋白以取得联合或协同的作用，如原癌基因、抗血管生成基因、自杀基因等。策略一：多启动子表达载体原理：带有各自独立启动子的多个表达盒构建于一个载原理：带有各自独立启动子的多个表达盒构建于一个载体上，转录出多种不同的体上，转录出多种不同的mRNAmRNA，并翻译出不同的蛋并翻译出不同的蛋白。白。优点：简便优点：简便缺点：缺点：内部启动子占据载体上有限的克隆空间内部启动子占据载体上有限的克隆空间 启动子间相互干扰，造成不同基因的表达水平启动子间相互干扰，造成不同基
2、因的表达水平 不一致不一致策略二：剪切载体l l原理：原理：利用一个启动子，在外源基因两侧提供剪切供利用一个启动子，在外源基因两侧提供剪切供体体/受体位点，通过剪切初始转录本，形成不同的受体位点，通过剪切初始转录本，形成不同的mRNAmRNA，分别表达两个基因分别表达两个基因l l缺点：可变剪切机制未明，双基因表达效率很不稳定缺点：可变剪切机制未明，双基因表达效率很不稳定不同来源的IRES序列组成不同，长度各异，在不同细胞类型中的作用也各异l l来源于闹心肌炎病毒来源于闹心肌炎病毒EMCVEMCV的该序列又称为不依赖帽的翻译增强的该序列又称为不依赖帽的翻译增强子，在大部分细胞中可直接招募核糖体
3、起始其下游顺反子的翻译。子，在大部分细胞中可直接招募核糖体起始其下游顺反子的翻译。但对其实密码的位置要求严格，只有该序列中的第但对其实密码的位置要求严格，只有该序列中的第1111个可作为起个可作为起始密码。始密码。l l来源于脊髓灰质炎或口蹄疫病毒的来源于脊髓灰质炎或口蹄疫病毒的IRESIRES序列对其后的任一个符合序列对其后的任一个符合KOZAKKOZAK序列的序列的AUGAUG均可有效的起始翻译，因而得到更为广泛的均可有效的起始翻译，因而得到更为广泛的应用。应用。l lIRESIRES序列置于两个顺反子之间时，它与第一个顺反子的终止密码序列置于两个顺反子之间时，它与第一个顺反子的终止密码的
4、最佳距离为的最佳距离为8080bpbp。少于少于4040或多于或多于300-400300-400bpbp会大大的降低会大大的降低IRESIRES序列的翻译效率。序列的翻译效率。策略五：基因之间以策略五：基因之间以FurinFurin的切割靶点序列连接的切割靶点序列连接l l原理：原理：FurinFurin是一种广泛存在的胞内蛋白酶，定位于高尔基复合体，是一种广泛存在的胞内蛋白酶，定位于高尔基复合体，在真核生物高度保守，可识别各种分泌型蛋白前体的精在真核生物高度保守，可识别各种分泌型蛋白前体的精-X-X-精精/赖赖-精氨酸共有序列并在此位点对其进行切割。利用这一点，将编码精氨酸共有序列并在此位点
5、对其进行切割。利用这一点，将编码切割位点的连接子置于分泌蛋白或膜结合蛋白的切割位点的连接子置于分泌蛋白或膜结合蛋白的cDNAcDNA序列间，序列间，转录时可以得到一条单顺反子，翻译成嵌合的融合蛋白，在加工转录时可以得到一条单顺反子，翻译成嵌合的融合蛋白，在加工过程中过程中FurinFurin切割成各个分离的蛋白产物，进而进行分泌性表达。切割成各个分离的蛋白产物，进而进行分泌性表达。l l特点：可以多基因表达。表达蛋白的摩尔比由载体上的编码序列特点：可以多基因表达。表达蛋白的摩尔比由载体上的编码序列数决定数决定l l细胞选择性：细胞选择性：COSCOS细胞中细胞中FurinFurin含量少，融合
6、基因的各蛋白表达量含量少，融合基因的各蛋白表达量低低;CHOCHO细胞中，精细胞中，精-X-X-赖赖-精介导的切割效率为精介导的切割效率为50%50%，而精，而精-X-X-精精-精只有精只有30%30%。策略六：基因之间以2A序列连接原理：原理：l l2 2A A是一种具有自我加工能力的蛋白酶，在不同病毒中它的长度、是一种具有自我加工能力的蛋白酶，在不同病毒中它的长度、作用位点各不相同。作用位点各不相同。l l在口蹄疫病毒中的在口蹄疫病毒中的2 2A A序列有长短两种类型，长型有序列有长短两种类型，长型有201201bpbp，编码编码3939个氨基酸，短型有个氨基酸，短型有9696bpbp，编
7、码编码1717个氨基酸。两者作用相似，均个氨基酸。两者作用相似，均可独立的用于构建多基因载体。可独立的用于构建多基因载体。l l将两基因分别克隆到将两基因分别克隆到2 2A A序列的两侧，去除上游基因的终止密码形序列的两侧，去除上游基因的终止密码形成单一的开放阅读框，翻译出的多聚蛋白可在编码成单一的开放阅读框，翻译出的多聚蛋白可在编码2 2A A区域的区域的C C末末端被切割为两个蛋白，上游蛋白融合了端被切割为两个蛋白，上游蛋白融合了2 2A A的的C C端多肽，并释放出端多肽，并释放出完整的下游蛋白。完整的下游蛋白。2A与Furin的不同之处：2 2A A的切割位点在自身的切割位点在自身C C端最末位的两个氨基酸之间端最末位的两个氨基酸之间（甘（甘-脯）脯）切割作用伴随翻译过程完成切割作用伴随翻译过程完成切割活性高达切割活性高达85%-99%85%-99%但是具体的切割机制不明但是具体的切割机制不明可用于与可用于与IRESIRES序列一起构建多顺反子载体。研究表明两序列一起构建多顺反子载体。研究表明两个近邻的个近邻的IRESIRES序列会降低基因的表达。因此，序列会降低基因的表达。因此，2 2A A序列在序列在构建多顺反子时是构建多顺反子时是IRESIRES序列的有益补充。序列的有益补充。
