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1、实验六实验六 碱法提取质粒碱法提取质粒 转到目录目目 录录 返回标题返回标题 一目的二原理附：原理示意图三试剂四器材五注意事项 六操作步骤 1 六操作步骤 2 六操作步骤 3GFPuv质粒的信息图片GFPuv vectors DescriptionLocation of features 1Location of features 2Location of features 3Location of features 4Vectors Primer LocationPropagation in E.coli一目的一目的了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。三个基本步骤：细菌的生长
2、和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化返回目录返回目录二原理二原理 质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验技术。质粒的提取是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等
3、被折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中。这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒DNA提取出来。原理示意图返回目录原理示意图原理示意图 返回目录返回目录 返回原理返回原理三试剂三试剂1.LB培养基 detail2.STE detail 3.溶液 I detail4.溶液 detail5.溶液III detail6.3M乙酸钠(pH5.2)detail7.TE(pH8.0)detail 返回目录 LB培养基培养基 back 配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bac
4、to-yeast extract)5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15 lbf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。STE back 0.1mol/L NaCl10mmol/L TrisCl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)在15 lbf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。溶液溶液 I back50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L TrisCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)在10 lbf/in2(6.8951
5、04Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4。溶液溶液 II back0.2 mol/L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS溶液溶液 III back5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。3M乙酸钠乙酸钠(pH5.2）back在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。0.5 mol/L EDTA(pH8.0)在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约
6、20g NaOH颗粒)，然后定容至1 L，分装后高压灭菌。1 mol/L TrisCl(pH8.0)n在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，定容至1 L，分装后高压灭菌。TE(pH8.0)back10 mmol/L TrisCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0)50TAE242g Tris 碱57.1 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)1TAEn0.04 mol/L Tris-乙酸n0.001 mol/L EDTA(pH 8.0)四四器材器材1.恒温摇床2.超净工作台3.离心机4.电泳仪和
7、电泳槽5.玻璃器皿与耗材 量筒、三角瓶、平皿;EP管(1.5ml,0.5ml);枪头(1ml,0.2ml,10l);牛皮纸、纱布、牙签等返回目录五操作步骤五操作步骤 1 1.挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3ml LB培养液中，37振荡培养1416小时。2.取1.2 ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。3.加入500l1ml STE buffer，涡旋打匀，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。4.加入预冷的溶液I 100l，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴5分钟 (重悬细胞)。5.加入200l溶液(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴 (碱变性染色体DNA、
8、蛋白质)。6.在5分钟内，加入溶液III 150l，轻柔颠倒510次，冰浴10分钟（利用pH差异，复性质粒DNA）7.返回目录五操作步骤五操作步骤 2 8.12,000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA，及不溶的变性蛋白，取上清。9.上清液用Tris-HCl饱和苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1-2次，每次剧烈振荡20秒，12,000rpm 离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为酚层。10.上清液用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm离心10分钟。11.上清液加入1/10体积 3M NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置10-15
9、分钟。12.在12,000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。返回目录五操作步骤五操作步骤 3 16.去上清，加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀。17.12,000rpm 离心10分钟。18.去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。19.加入3050l ddH2O或TE（pH 8.0），溶解质粒。20.加入RNaseA使终浓度为20g/ml，室温放置30分钟1小时。21.1%琼脂糖凝胶电泳检测所提质粒DNA纯度及浓度。22.取1-5l DNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转入 分光光度计的石英比色杯中，测定 OD260及OD280，并计算OD260/OD280比值和DNA浓度：DNA浓度浓度=OD26
10、0稀稀释释倍数倍数50/100050/1000（g/l）返回目录分次收集4ml菌液离心，留沉淀五操作步骤五操作步骤 4 琼脂糖（琼脂糖（1%）凝胶电泳）凝胶电泳1.称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入1TAE，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；2.溶液冷至60，加入 EB至终浓度为0.5g/ml，混匀，注意戴手套操作；3.将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡；4.待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入1TAE电泳buffer，让液面高出胶面1mm；5.在DNA样品中加入1/6 loading bu
11、ffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为1-5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）；6.根据指示剂的位置，判断是否终止电泳。返回目录pGFP pBSK M六六注意事项注意事项 为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒510次)，使蛋白质和核酸变性；加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡510次)，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。返回目录周四：熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5/0.5 ml离
12、心管，装牙签及配溶液等 50TAE:500 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0):500 ml 1mol/L Tris.Cl(pH8.0):500 ml 0.1mol/L CaCl2:500 ml ddH2O:每组100 ml 5 mol/L NaOH:100 ml 配LB培养基 液体：全班1000 ml150 ml4 瓶（Amp+）(终浓度为60g/ml)，用于两个质粒的接种100 ml 4瓶(Amp-)，留做感受态细胞 固体（含1.5%琼脂粉）：每组100 ml，共1500ml，可一起配再分装每组倒5个平板（Amp+），用于次周转化灭菌。七七实验安排实验安排周五：用Kit 提取质
13、粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒 各一管，每管60l取1-2l电泳，1-5l用dd H2O稀释后 在紫外分光光度计下测 OD260及OD280，并计算浓度对质粒酶切过夜周六：酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳用Kit对酶切后的DNA（pBSK 大片段和GFP基因片段）片段进行胶回收每组用一个柱子回收电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收 DNA的浓度后，存放于-20冰箱中七实验安排七实验安排-续续GFPuv质粒的信息图片质粒的信息图片返回目录GFPuv vectors DescriptionpGFPuv carries the“cyc
14、le 3”variant of GFP described by Crameri et al.(1).This gene was cloned between the two MCSs of the pUC19 derivative pPD16.43(2).The GFPuv gene can be easily excised from pGFPuv.Alternatively,the GFPuv coding sequence can be amplified by PCR.The GFPuv gene was inserted in frame with the lacZ initiat
15、ion codon from pUC19 so that a b-galactosidase-GFPuv fusion protein is expressed from the lac promoter in E.coli.Note,however,that if you excise the GFPuv coding sequence using a restriction site in the 5 MCS,the resulting fragment will encode the native(i.e.,non-fusion)GFPuv protein.The pUC backbon
16、e of pGFPuv provides a high copy number origin of replication and ampicillin resistance gene for propagation in E.coli.返回目录GFPuv vectors Location of features 1 lac promoter:95178 CAP binding site:111124 35 region:143148;10 region:167172 Transcription start point:179 lac operator:179199 lacZ-GFPuv fusion protein expressed in E.coli Ribosome binding site:206209 Start codon(ATG):217219;Stop codon:10031005 5 MCS:234281返回目录GFPuv vectors Location of features 2 GFPuv gene Start codon(ATG):289291;Stop c
