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1、 第六章第六章 酶、细胞、原生质体固定化酶、细胞、原生质体固定化 1.1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。剂对其有影响）。2.2.不能回收，生产成本提高。不能回收，生产成本提高。3.3.产物中混杂酶蛋白，增加了产物分离纯化的产物中混杂酶蛋白，增加了产物分离纯化的难度。难度。改善方法：改善方法：固定化生物技术固定化生物技术 游离酶的缺点：游离酶的缺点：一、定义及特点一、定义及特点 1.1.固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催固定在载体上并在一
2、定空间范围内进行催化反应的酶。化反应的酶。第一节第一节 酶、细胞、原生质体固定化酶、细胞、原生质体固定化什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术优点：优点：(1)(1)可提高稳定性。可提高稳定性。(2)(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点：缺点：(1)(1)存在扩散限制。存在扩散限制。(2)(2)酶活性下降。酶活性下降。2.2.固定化细胞（固定化细胞（immobilized cellimmobilized cell）固定在载体上并在一定空间范围内进行固定在载
3、体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。优越性：优越性：(1)(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。完成部分代谢过程。局限性：局限性：(1)(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的细胞内多种酶的存在，会形成不需要的 副产物。副产物。(2)(2)只适用于生产胞外酶和其他能分泌到胞只适用于生产胞外酶和其他能分泌到胞 外的产物外的产物 (3)(3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩
4、散限 制作用制作用。3.3.固定化原生质体固定化原生质体概念：概念：固定在载体上，在一定空间范围内进行生固定在载体上，在一定空间范围内进行生命活动的原生质体。命活动的原生质体。意义意义：(1)(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。泌。(2)(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高载体的保护作用，稳定性提高。二、固定化方法二、固定化方法固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法（一）酶的固定化
5、方法吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微囊型离子交离子交换吸附换吸附物理物理吸附法吸附法 依据带电的酶或细胞和载体之间的静电依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。换剂上。1.1.吸附法（吸附法（adsorptionadsorption）根据吸附剂的特点分根据吸附剂的特点分:1 1）物理吸附法（）物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）作用力：作用力：氢键、疏水键氢键、疏水键常用载体：常用载体：活性炭，氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、活性
6、炭，氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。2 2）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding）作用力：作用力：离子键离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素优点：优点：条件温和，操作条件温和，操作简便，酶活力损失少。简便，酶活力损失少。缺点：缺点：结合力弱，易解结合力弱，易解吸附吸附。借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团和载体的功团和载体的功能基团进行偶能基团进行偶联。联。2.2.共价偶联法（共价偶联
7、法（covalent binding covalent binding or covalent couplingor covalent coupling）1 1）载体：）载体：如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙2 2）偶联方法：）偶联方法：偶联成功与否取决于：偶联成功与否取决于：载体：载体：功能基团：芳香氨基，羧基，功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。羧甲基等。酶分子酶分子:侧
8、链非必需基团：羧基，巯侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。基，羟基，酚基，咪唑基。常用的偶联反应有：重氮化法、常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。（P184P184）优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。易脱落，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。的空间构象而影响酶的催化活性。3.3.交联法（交联法（crosslinkingcrosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间发生交借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方
9、法。联的固定化方法。双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法不使用载体。交联法不使用载体。交联反应既能发生在分子间，也可发生交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。在分子内。酶酶浓浓度度低低时时，交交联联发发生生在在分分子子内内，酶酶仍仍保保持溶解状态。持溶解状态。酶酶浓浓度度高高时时，交交联联发发生生在在分分子子
10、间间，酶酶变变为为不溶态。不溶态。缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。带来不便。故多采用双重固定化故多采用双重固定化 4.4.包埋法（包埋法（entrapmententrapment）将酶用物理的方法将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚包埋在各种载体（高聚物）内。分为：物）内。分为：网格型：网格型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。分子凝胶细微网格中。微囊型：微囊型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子半透膜中。分子半透
11、膜中。1）网格型包埋法网格型包埋法（gel(lattic)entrapmentgel(lattic)entrapment）又称凝胶包埋法又称凝胶包埋法凝胶凝胶包埋条件包埋条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法：滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法：
12、滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：AP及及TEMEDAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)光交联树脂包埋法：光交联树脂包埋法：光交联树脂预聚物光交联树脂预聚物+E(or cell)紫外照射紫外照射IE(or IC)2 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法（microencapsulationmicroencapsulation）又称半透膜包埋法又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几。半透膜：直径几十微米到几百
13、微米，厚约百微米，厚约25nm25nm。半透膜孔径半透膜孔径 80%80%活性。活性。（三）酶的最适温度（三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上 升（有例外）。升（有例外）。（四）酶的最适（四）酶的最适pHpH a.a.载体性质的影响载体性质的影响 带负电荷载体带负电荷载体 ：最适：最适pH pH 向碱性偏移。向碱性偏移。带正电荷载体带正电荷载体 ：最适：最适pH pH 向酸性偏移。向酸性偏移。b.b.产物性质的影响产物性质的影响产物为酸性时，最适产物为酸性时，最适pHpH比游离酶高一些
14、比游离酶高一些产物为碱性时，最适产物为碱性时，最适pHpH比游离酶低一些比游离酶低一些 与自然酶基本相同。但大分子底与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。发生改变。（五）酶的作用专一性（五）酶的作用专一性 与固定化酶相比，固定化细胞的情与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。况比较复杂。（1 1）细胞的存活率和稳定性提高。）细胞的存活率和稳定性提高。（2 2）产率增加）产率增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。二、固定化细胞的性质二、固定化细胞的性质 乙酰乙酰-DL 氨基酸氨基酸 L 氨
15、基酸氨基酸+乙酸乙酸 乙酰乙酰-D 氨基酸氨基酸第三节第三节 固定化酶与固定化细胞的应用固定化酶与固定化细胞的应用 一、在工业生产上的应用一、在工业生产上的应用 1.氨基酰化酶（氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶酰化酶酰化酶泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化固定化酶柱子酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala 2.2.葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 世界上生产规模世界上生产规模最大，应用最为成功最大，应用最为成功的一种固定化酶。的一种固定化酶。二、固定化酶在医学上的应用二、固
16、定化酶在医学上的应用 1.消血栓：消血栓：n纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。反应，无法长期使用。n酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。能自由进出。2.2.人工肾：人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。和微胶囊活性炭组成人工肾。1.1.酶传感器酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。固定化酶和电化学传感器的结合。优点：优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定能够直接在复杂试样中进行测定。三、在分析检测中的应用三、在分析检测中的应用 19
