《分子生物学技术6》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学技术6（273页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第六章第六章 分子生物学技术分子生物学技术 生化技术生化技术 电泳电泳 层析层析 离心离心 分光光度分光光度 基因操作基因操作 其它其它基因工程基因工程 分分 切切 接接 转转 筛筛 表表 电泳电泳 层析层析 离心离心 分光光度分光光度 基因操作基因操作 其它其它 分（离目的基因）分（离目的基因）切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）基本模式“纵向”体系“横向”体系第一节 核酸及蛋白质操作技术uDNADNA操作技术操作技术uRNARNA操作技术操作技
2、术u蛋白质操作技术蛋白质操作技术uDNADNA操作技术操作技术DNA的分离DNA的纯化DNA的鉴定DNA的扩增及基因文库的构建uRNARNA操作技术操作技术RNA的分离RNA的纯化RNA的鉴定cDNA的扩增及cDNA文库构建一、核酸操作技术一、核酸操作技术（一）核酸的分离与纯化（一）核酸的分离与纯化基本原则基本原则：1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础；2、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。核酸提取的主要步骤来源：细胞（包括培养细胞）、病毒温和裂解，溶解核酸，使核酸与蛋白（组蛋白）分离；采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。生物样本（细胞
3、、病毒）破碎分离纯化质量测定保存核酸核酸的的贮存贮存核酸分离提取的基本步骤核酸分离提取的基本步骤Step1Step2Step3Step4细胞的破碎：细胞的破碎：物理方法物理方法溶胀和自溶溶胀和自溶化学方法化学方法生物酶降解生物酶降解核酸核酸的的纯化纯化核酸核酸的的浓缩浓缩和和沉淀沉淀抑制抑制RNaseRNase活性是提取活性是提取RNARNA的关键的关键在实验中，严格控制内源性和外源性在实验中，严格控制内源性和外源性RNaseRNase的污染。的污染。RNaseRNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。菌等。外源性外源性RNaseRNase
4、 存在于操作人员的手汗、唾液等，存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的用的RNaseRNase也会造成污染。这些外源性的也会造成污染。这些外源性的RNaseRNase可可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。人员的手及各种试剂。各种组织和细胞中则含有大量各种组织和细胞中则含有大量内源性的内源性的RNaseRNase。RNARNA操作中的要求操作中的要求防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器
5、皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2 室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPCDEPC）：
6、）：是一种强烈但不彻底的是一种强烈但不彻底的RNARNA酶酶抑制剂。它通过和抑制剂。它通过和RNARNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。2.2.异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的目前被认为是最有效的RNARNA酶抑制剂，它酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使在裂解组织的同时也使RNARNA酶失活。它既可破坏细胞结构酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNARNA酶有强烈的变性作酶有强烈的变性作用。用。3.3.氧钒核糖
7、核苷复合物：氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和物，它和RNARNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNARNA酶的活性。酶的活性。4.4.RNARNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasinRNasin）：）：从大鼠肝或人胎盘中从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。提取得来的酸性糖蛋白。RNasinRNasin是是RNARNA酶的一种非竞争性酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种抑制剂，可以和多种RNARNA酶结合，使其失活。酶结合，使其失活。5.5.其它：其它：SDSSDS、尿素、硅藻土等对、尿素
8、、硅藻土等对RNARNA酶也有一定抑制作用。酶也有一定抑制作用。RNA的分离和纯化-TRIzol试剂法原理：首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，加入氯仿产生第二相，离心后，RNA存在于水相。经异丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern杂交分析、RT-PCR等；存在于有机相的DNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到的DNA大小约20Kb，适用于PCR的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。（二）、核酸的鉴定（二）、核酸的鉴定1、核酸分子杂交鉴定核酸分子杂交鉴定（1）核酸分子杂交的基本原理（见第二章）核酸分子杂交的基本原理（见第二章）（2）影响杂交的因素）影响杂交的因
9、素 a.核酸分子的浓度和长度：核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂浓度过高影响杂 交效率交效率 b.温度：温度：DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低2025 RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低杂交，加甲酰胺降低 Tm值值 用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5 c.离子强度：离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着
10、盐浓度增加，杂交率低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加增加高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 d.甲酰胺：甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在354
11、2 杂交杂交如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交杂交 e.核酸分子的复杂性：核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度长度 Cot与反应体系中核酸复杂性成正比与反应体系中核酸复杂性成正比 两个两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性 f.非特异性杂交反应：非特异性杂交反应：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附特异性吸附
12、常用的封闭物有两类：即非特异性常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化和高分子化合物。如鲑精合物。如鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液溶液或脱脂奶粉或脱脂奶粉（3)、核酸分子杂交的方法核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固固-液相杂交液相杂交膜上印迹杂交膜上印迹杂交原位杂交原位杂交 液相杂交液相杂交RNA酶保护分析法酶保护分析法核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交斑点印迹为圆形斑点印迹为圆形狭缝印迹为线状狭缝印迹为线状鉴别鉴别DNA、RNA简单、快速，同一张膜可检测多个样品简
13、单、快速，同一张膜可检测多个样品特异性不高、不能鉴别核酸分子量特异性不高、不能鉴别核酸分子量固液杂交固液杂交膜上印迹杂交膜上印迹杂交Southern和和Northern杂交（略）杂交（略）原位杂交原位杂交定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交杂交固液固液杂交杂交 保持组织细胞的形态保持组织细胞的形态 对核酸
14、无抽提，修饰与降解作用对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定理化性质稳定 杂交过程：杂交过程：（1）组织或细胞的固定）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：理想固定液应具备：（2）组织细胞杂交前的预处理）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如去垢剂（如Triton x-100和和SDS）和蛋白酶）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消
15、化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落片上脱落（3）探针的选择与标记）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为探针的长度一般为50300bp,有时达有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察于观察（4）杂交）杂交 杂交液体积小：杂交液体积小：1020l cDNA和和RNA探
16、针杂交温度约为探针杂交温度约为50 杂交时间杂交时间:DNA探针杂交为探针杂交为24h.RNA探针杂交过夜探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置杂交前一般将组织切片置95 515分钟使分钟使DNA变性变性 冲洗温度一般冲洗温度一般 不超过不超过50（5）杂交结果检测）杂交结果检测 所用探针为核素标记所用探针为核素标记,放射自显影检测放射自显影检测 所用探针为非核素标记所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测比色或化学发光检测检测目标菌落的杂交技术检测目标菌落的杂交技术检测目标菌落的杂交技术检测目标菌落的杂交技术菌落杂交菌落杂交原位原位杂交杂交液相杂交液相杂交指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。A、RNA酶保护分析法酶保护分析法a.RNA酶保护分析法原理酶保护分析法原理RNaseA和和RNaseT1专一水解杂交体系中的专一水解杂交体系中的单链单链RNA，不水解探针，不水解探针RNA与待测与待测RNA互补形互补形成的双链成的双链RNA，使杂交分子得到保护
