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1、一、柠檬酸简介一、柠檬酸简介v柠檬酸又名枸橼酸，学名柠檬酸又名枸橼酸，学名-羟基丙烷三羧酸，是生物体主羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗羟基丙三羧酸，英文文献俗名名citric acid，分子式，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。应。第一节第一节 概述概述第四章第四章 柠檬酸发酵机制柠檬酸发酵机制食品工业：食品工业：主要作为饮品的主要作为饮品的酸味剂酸味剂，用于各种清凉饮料，还有，用于各种清凉
2、饮料，还有汽水、糖果、饼干、罐头、果酱、果汁等食品的制造。汽水、糖果、饼干、罐头、果酱、果汁等食品的制造。也可用作油脂也可用作油脂的的抗氧剂抗氧剂；医药工业：医药工业：是许多医药品的是许多医药品的原材料原材料，如柠檬酸哌吡嗪（驱蛔虫，如柠檬酸哌吡嗪（驱蛔虫药）、柠檬酸铁铵（补血剂）、柠檬酸钠（输血剂）等。此外，柠檬药）、柠檬酸铁铵（补血剂）、柠檬酸钠（输血剂）等。此外，柠檬酸还用在许多医药中做酸还用在许多医药中做酸化剂酸化剂；化学工业：化学工业：柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂，来制造食品包柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂，来制造食品包装的塑料薄膜；装的塑料薄膜；其它方面，其它方面，如用于工业、民
3、用的洗涤剂中作为助剂，制造无公如用于工业、民用的洗涤剂中作为助剂，制造无公害洗涤剂；用在混凝土中作缓凝剂；在电镀中、皮革业、油墨、晒图害洗涤剂；用在混凝土中作缓凝剂；在电镀中、皮革业、油墨、晒图等工业中也被得到广泛应用。等工业中也被得到广泛应用。二、柠檬酸的应用概况二、柠檬酸的应用概况三、我国柠檬酸生产现状三、我国柠檬酸生产现状 生产状况：生产状况：60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产以上。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有家。主要有安徽
4、丰原生物安徽丰原生物化学集团公司化学集团公司（生产能力为（生产能力为12.0万吨万吨/年）、年）、江苏无锡罗氏江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司中亚柠檬酸有限公司（生产能力为（生产能力为4.0万吨万吨/年）、年）、安徽华安徽华源生物药业有限公司源生物药业有限公司（生产能力为（生产能力为3.5万吨万吨/年）等。年）等。v存在问题：存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。，行业经济效益呈滑坡态势。第二节第二
5、节 柠檬酸合成途径与代谢调控柠檬酸合成途径与代谢调控 1940年，年，Krebs:TCA；1953年，年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在证实黑曲霉中存在EMP途途径所有酶；径所有酶；1954年，年，Shu提出葡萄糖提出葡萄糖80%经经EMP途径代谢；途径代谢；1954-1955年，年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存等发现黑曲霉中存在在TCA循环。循环。一、柠檬酸合成途径的发现一、柠檬酸合成途径的发现二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径 黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经萄糖经EMP、HMP途
6、径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰脱羧生成乙酰CoA，另一方面经，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。缩合生成柠檬酸。(1)生长期与产酸期都存在生长期与产酸期都存在EMP与与HMP途径，前者途径，前者EMP:HMP=2:1，后者，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵，当柠檬酸积累时，以糖质原料发酵，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被和乙醛酸循环被阻断或减弱阻断或减弱
7、。(3)由于由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸草酰乙酸是由是由丙酮酸（丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。）羧化生成的。即由两个即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化下固定化CO2生成草酰乙酸为主。生成草酰乙酸为主。三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制 1、磷酸果糖激酶（、磷酸果糖激酶（PFK）：）：（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响浓度对磷酸果糖激酶的影响 Mn2+缺乏为
8、何会使缺乏为何会使NH4+浓度升高呢浓度升高呢？当培养基中当培养基中Mn2+缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Gln等），这些氨基酸的积累，意味着等），这些氨基酸的积累，意味着体内体内蛋白质的合成受阻蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样到影响，这样NH4+的消耗下降，的消耗下降，NH4+浓度就会升高。浓度就会升高。磷酸果糖激酶（磷酸果糖激酶（PFKPFK）的调节）的调节 柠檬酸和ATP对该酶有抑制 生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和A
9、TP对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量 Mn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制2、CO2固定反应 v通过 CO2固定反应提供C4二羧酸 v（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶v（2）丙酮酸+CO2 =草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶v 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。v草酰乙酸的积累利于加速柠檬酸合成（二）三羧酸循环的调节（二）三羧酸循环的调节1、柠檬酸合成酶的调节：、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是柠檬酸合成酶是TCA
10、循环第一个酶。循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：顺乌头酸水合酶、顺乌头酸水合酶、NAD和和NADP-异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸在柠檬酸产生与不产生时，这产生与不产生时，这3种酶均存在（种酶均存在（组成酶组成酶）；而控制铜离子）；而控制铜离子0.3mg/L，铁离子，铁离子2mg/L和和pH2.0情况下，这情况下，这3种酶均不出现活种酶均不出现活力。力。顺乌头酸水合酶顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸是催化柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬异柠檬酸可逆反应。研究表明，黑
11、曲霉中有一种单纯的位于线粒酸可逆反应。研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸柠檬酸:顺乌头酸顺乌头酸:异柠檬酸异柠檬酸90:3:7。铁为顺乌头酸酶的激铁为顺乌头酸酶的激活剂，活剂，3、-酮戊二酸脱氢酶的调节酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特循环的一个显著特点是，点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸
12、生成期，菌体内不存在不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。酮戊二酸脱氢酶或活力很低。-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCATCA循环中循环中唯一不唯一不可逆反应可逆反应，一旦，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：TCATCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆逆TCATCA循环生成，使循环生成，使TCATCA循环成循环成“马蹄形马蹄形”。-酮戊酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。v菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙
13、酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。（三）能荷（三）能荷调节对柠檬酸发酵的影响v如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。解偶联剂（解偶联剂（uncoupleruncoupler）v使氧化和磷酸化脱偶
14、联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+梯度，因而无ATP生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。常用解偶联剂主要有：v质子载体：2，4-二硝基酚(DNP)，羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。v质子通道：增温素（thermogenin）。v其它离子载体：如缬氨霉素。v某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。v一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP；能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。v实
15、验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（20分钟），则这一侧系呼吸链不可逆的失活不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸琥珀酸琥珀酸异柠檬酸异柠檬酸苹果酸苹果酸延胡索酸延胡索酸乙醛酸乙醛酸乙酰乙酰CoA乙酰乙酰CoA乙酸乙酸乙酸乙酸（四）乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸（四）乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸v丙酮酸脱羧反应是不可逆的，存在丙酮酸脱羧反应是不可逆的，存在异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶，草酰乙，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成酸的供给
16、只能由乙醛酸循环来完成v3醋酸醋酸 1柠檬酸柠檬酸v生成的柠檬酸一半生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸转化为异柠檬酸v顺乌头酸水合酶催顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸顺乌头酸 =90：7：3。细胞质中积。细胞质中积累大量异柠檬酸。累大量异柠檬酸。MnMn2+2+缺乏缺乏抑制蛋白合成抑制蛋白合成NHNH4 4+，有一条呼吸活动强的不产，有一条呼吸活动强的不产生生ATPATP的侧呼吸链：的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节解除磷酸果糖激酶的代谢调节解除磷酸果糖激酶的代谢调节解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进促进促进促进EMPEMPEMPEMP途径途径途径途径畅通。畅通。畅通。畅通。丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰生成乙酰CoACoA和和COCO2 2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。被调节，增强了合成柠檬酸的能力。小结：小结：顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：顺乌头酸水合酶在催化
