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1、第二节第二节多肽与蛋白质类药物多肽与蛋白质类药物一、多肽与蛋白质类药物概述一、多肽与蛋白质类药物概述多多肽肽和和蛋蛋白白质质是生物体广泛存在的重要。具有多种多样的生理生化功能生理生化功能，也是一类重要的生物药物。（一）多肽类药物（一）多肽类药物活活性性多多肽肽是生化药物中非常活跃的一个领域。动物体内已已知知的的活活性性多多肽肽主要是从内内分分泌泌腺腺、组组织织器器官官、分分泌泌细细胞胞和和体体液液中中产生获得的。从植物中发现和研研究究新的活性多肽新的活性多肽也引起了人们广泛的注意。许多活活性性蛋蛋白白质质、多多肽肽都是由无无活活性性的的蛋蛋白白质质前前体体，经过酶的加工剪切转化加工剪切转化而来
2、的。从寻找新新药药的的角角度度看看，研究活活性性多多肽肽结结构构与与功功能能的关系，有助于了解多肽中哪哪些些氨氨基基酸酸序序列列是是活活性性所所必需的必需的，以便以更短的多肽来代替。用不同的氨基酸去置置换换活性多肽中的有关氨基酸，可以提高其生理活性，减少临床的不良反应不良反应。同时，对氨基酸排排列列形形式式立立体体结结构构的的研研究究，有助于设计新的活性多肽类药物活性多肽类药物。目前，主要的多肽类药物多肽类药物有以下几种：1、多肽激素、多肽激素（1）垂体多肽激素（2）下丘脑激素（3）甲状腺激素（4）胰岛激素（5）胃肠道激素（6）胸腺激素2、多肽类细胞生长调节因子、多肽类细胞生长调节因子表皮生长
3、因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。3、含有多肽成分的其他生化药物、含有多肽成分的其他生化药物（二）蛋白类药物（二）蛋白类药物蛋白质生化药物除了蛋蛋白白质质类类激激素素和和细细胞胞生生长长调调节节因因子子外，还有像血血浆浆蛋蛋白白质质类类、黏黏蛋蛋白白、胶胶原原蛋蛋白白及蛋白酶抑制剂及蛋白酶抑制剂等大量的其他生化药物品种。作作用用方方式式也从生化药物对机机体体各各系系统统和细细胞胞生生长长的的调调节节扩展到被被动动免免疫疫、替替代代疗疗法法、抗抗凝凝血血剂剂以以及及蛋蛋白酶的抑制剂白酶的抑制剂等多种领域。自20世纪70年代后期开始，人们首先把目标集中在应用基因工程技术制造重要
4、的蛋白质药物应用基因工程技术制造重要的蛋白质药物上。现正从微微生生物物和和动动物物细细胞胞的表达向转转基基因因动动植植物物发展。鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的抗抗原原性性、容容易易失失活活、在体内的半半衰衰期期短短、用用药药途途径径受限等难以克服的缺点。对一些蛋白质类生化药物进行结结构构修修饰饰、应用计计算算机机图图像像技技术术研研究究蛋蛋白白质质与与受受体体及及药药物物的的相相互互作作用用、发展蛋蛋白白质质工工程程及设计相对简单的小小分分子子来代代替替某某些些大大分分子子蛋蛋白白质质类类药药物物并且起到增增强强或或增增加加选选择择性性疗疗效效的作用等。主要蛋白质类药物有以下几种：主要蛋
5、白质类药物有以下几种：1、蛋白质激素、蛋白质激素（1）垂体蛋白质激素。（2）促性腺激素。（3）胰岛素及其他蛋白质激素胰岛素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素。2、血浆蛋白质、血浆蛋白质3、蛋白质类细胞生长调节因子、蛋白质类细胞生长调节因子4、黏蛋白、黏蛋白5、胶原蛋白、胶原蛋白6、碱性蛋白质、碱性蛋白质硫酸鱼精蛋白等。7、蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂等。8、植物凝集素、植物凝集素二、多肽与蛋白质类药物的制造方法二、多肽与蛋白质类药物的制造方法目前用于多多肽肽和和蛋蛋白白质质类类药药物物的的制制造造方方法法主要有三种：提提取取分分离离纯纯化化法法、化化学学合合成成法法
6、和和基基因因工工程程法法。这里重点介绍提取分离纯化法提取分离纯化法。（一）蛋白质与多肽类药物提取、分离纯化（一）蛋白质与多肽类药物提取、分离纯化1、材料选择、材料选择采用提取分离纯化法获得的多肽及蛋白质类药物，其原原料料的的主主要要来来源源有有动动植植物物组组织织和和微微生生物物等，原则是要选择富富含含所所需需蛋蛋白白质质多多肽肽成成分分的、易于获获得得和易于提取提取的无害生物材料无害生物材料。对天天然然蛋蛋白白质质类类药药物物，为提高质质量量、产产量量和降低生产成成本本，对原料的种种属属、发发育育阶阶段段、生生物物状状态态、来来源源、解解剖剖部部位位、生生物物技技术术产产品品的的宿宿主主菌菌
7、或或细细胞胞都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作分离纯化工作事半功倍。（1）种属）种属牛胰含胰岛素单位比猪胰高。抗抗原原性性则猪猪胰胰岛岛素素比比牛牛胰胰岛岛素素低，前者与人胰岛素相比，只有1个个氨氨基基酸酸的差异，而牛有3个个氨氨基基酸酸的差异。由于种种属属特特异异性性的的关关系系，用猪垂体制造的生生长长素素对人体无效，不能用于人体。由动物细胞产生的干干扰扰素素与与人人干干扰扰素素抗抗原原有有交交叉叉反反应应，而对一些非非同同源源性性动动物物的某些细胞抗抗病病毒毒活活性性作用并不下降。（2）发发育育生生长长阶阶段段幼年动物的胸胸腺腺比比较较发发达达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料胸腺原料
8、必须采用幼龄动物幼龄动物。HCG在妊娠妇女6070d的尿中达到高峰，到妊娠18周已降到最低水平。然而HMG必须从绝绝经经期期的妇女尿中获取。肝肝细细胞胞生生长长因因子子是从肝肝细细胞胞分分化化最最旺旺盛盛阶阶段段的的胎胎猪猪或或胎胎牛牛肝肝中获得的，若用成年动物，必须经过肝肝脏脏部部分分切切除除手手术术后，才能获得富富含含肝肝细细胞胞生生长长因因子子的原料。（3）生生物物状状态态动动物物饱饱食食后后宰宰杀杀，胰脏中的胰胰岛岛素素含含量量增增加加，对提取胰岛素有利，但胆胆囊囊收收缩缩素素的分泌使胆汁排空胆汁排空，对胆汁的收集不利收集不利。（4）原原料料来来源源血血管管舒舒缓缓素素可分别从猪猪胰胰
9、脏脏和和猪猪颚颚下下腺腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚颚下腺下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶蛋白水解酶。（5）原原料料解解剖剖学学部部位位猪胰脏中，胰胰尾尾部部分分含激激素素较多，而胰胰头头部部分分含消消化化酶酶较多，如分别摘取则可提高各产品的收率：胃胃膜膜素素以采取全全胃胃黏黏膜膜为好，胃胃蛋蛋白白酶酶则以采取胃底部黏膜胃底部黏膜为好，因胃底部黏膜富含消化腺消化腺。2、提取、提取提取的总要求是最最大大限限度度地把有效成分提取出来，关键是溶剂的选择溶剂的选择。提取所用溶剂的选选择择标标准准，首先对被制备物具有最最大大溶溶解解度度，并在提取中尽可能减减少少一一些些不不必必要要的的成
10、成分分。为了更好地达到以上两个目的，常用的手段是调整溶剂的pH、离子强度、溶剂成分配比和温度范围、离子强度、溶剂成分配比和温度范围等。3、分离纯化、分离纯化多多肽肽及及蛋蛋白白质质的分离纯化是将提取液中的目的蛋白质与其他非非蛋蛋白白质质杂杂质质及及各各种种不不同同蛋蛋白白质质分分离离开开来来的过程，常用的分离纯化方法分离纯化方法有：（1）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽及氨基酸都是两两性性电电解解质质。其净电荷为零，此时环境的pH即为该蛋白质的等电点等电点。在等电点时蛋白质性性质质比比较较稳稳定定，其物理性质如导导电电性性、溶溶解解度度、黏黏度
11、度、渗渗透透压压等皆最小，因此可利用蛋白质等等电电点点时时溶溶解解度度最最小小的的特特性性来制备或沉沉淀淀蛋蛋白质白质。两两性性物物质质的的等等电电点点会会因因条条件件不不同同（如在不不同同离离子子强强度度的不同缓冲溶液中，或含含有有一一定定有有机机溶溶媒媒的溶液中）而改变而改变。蛋白质在介质中的等等电电点点是和介质中其其他他成成分分的的存在存在有关系的。用等等电电点点法法沉沉淀淀蛋白质常需配配合合盐盐析析操操作作，而除去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作配合热变性操作。等等电电聚聚焦焦电电泳泳除了用于分离蛋白质外，也可用于测定蛋白质的等电点测定蛋白质的等电点。（2）根根据据蛋蛋白白质质分分
12、子子形形状状和和大大小小的的不不同同来来纯纯化化蛋蛋白白质质蛋白质的一个主要特点是分分子子大大，而且不同种类的蛋白质分子大大小小也也不不相相同同。由此可以用凝凝胶胶过过滤滤法法、超超滤滤法法、离离心心法法及及透透析析法法等将蛋白质与其他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。用超超滤滤法法时，超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈呈线线性性溶溶质质或者是球形溶质的区别或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结果。葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶含有少少量量的的酸酸性性基基团团，故有较较弱弱的的离离子子交交换换作作用用，此外还有吸吸附附作作用用。可采用低低浓浓度度的的盐盐溶溶
13、液液，或者用与待分离蛋白质相同的标准蛋白质预预先先使使凝胶柱平衡凝胶柱平衡，以期不损失所分离的蛋白质。（3）根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质）根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度受溶液的pH、离离子子强强度度、溶溶剂剂的的电电解解质质性性质质及及温温度度等多种因素的影响。适当改变外界条件，可以有选择地控控制制某某一一种种蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度，达到分离的目的。属于这一类的分离方法有蛋蛋白白质质的的盐盐溶溶与与盐盐析析法法、结晶法和低温有机溶剂沉淀法结晶法和低温有机溶剂沉淀法。乙乙醇醇和和丙丙酮酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂，由由于于丙丙酮酮的的介介电电常
14、常数数小小于于乙乙醇醇，故丙酮沉淀能力比乙醇强。根据实践，乙乙醇醇沉沉淀淀的的物物质质，改改用用丙丙酮酮可可减减少少l0左右左右。（4）根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质）根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离离子子交交换换剂剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团。它对溶液中不不同同的的带带电电物物质质呈现不同的亲和力亲和力，从而使这些物质分离提纯分离提纯。对蛋白质的离子交换层析，一般多用离离子子交交换换纤纤维维素素或或以以葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶等等为为骨骨架架的的离离子子交交换换剂剂。主要是取其有较大的蛋白质吸附容量吸附容量、较高的流
15、速流速和分辨率分辨率等优点。可按不同情况选择离子交换条件：可按不同情况选择离子交换条件：如果吸吸附附得得太太牢牢，可改用交交换换当当量量较小的交换剂，或改变条件降低交换剂上带电基团的解离度降低交换剂上带电基团的解离度。（5）根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质）根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质主要的手段是亲亲和和层层析析法法，即利用蛋白质分子能与其相应的配配体体进行特特异异的的、非非共共阶阶键键的的可可逆逆性性结结合合而达到纯化的目的纯化的目的。用亲和层析纯化某种蛋白质，有时并不能取得预期的效果。原因之一就是是非非专专一一性性吸吸附附问问题题，非专一地吸附一些无无关关的的蛋蛋白白质质而
16、与专专一一吸吸附附的的蛋蛋白白质质相混杂，影响了分离效果。非专一性吸附主要来自吸附剂上的离离子子基基团团和和疏疏水水基团基团。固固相相化化金金属属亲亲和和层层析析（IMAC）蛋白质分子中的咪咪唑基和巯基唑基和巯基可与一些金属元素形成配位结合配位结合。（6）根根据据蛋蛋白白质质疏疏水水基基团团与与相相应应的的载载体体基基团团结结合合来来纯化蛋白质纯化蛋白质蛋白质分子上有疏水区，这些疏水区，能够与吸吸附附剂剂上的疏疏水水基基团团结结合合，再通过降低介质的离子强度和极性，或用含有去垢垢剂剂的的溶溶剂剂，提高洗洗脱脱剂剂的pH等方法将蛋白质洗脱下来。（7）根根据据蛋蛋白白质质在在溶溶剂剂系系统统中中分分配配的的不不同同来来纯纯化化蛋蛋白质白质这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程，称之为逆逆流流分分溶溶，利利用用逆逆流流分分溶技术分离溶技术分离垂体激素、氨基酸、激素、氨基酸、DNA是很有效的。（8）根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质）根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结结晶晶磷磷酸酸钙钙（羟羟灰灰石石）、磷磷酸酸钙钙凝凝胶胶、
