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1、1.1DNA重组技术的基本工具专题1基因工程高考试题高考试题核心考点核心考点考查内容考查内容20202020年课标年课标，3838基因工程基因工程，胚胎工程，胚胎工程基因工程的工具和操作程序，基因工程的工具和操作程序，体外受精和早期胚胎培养体外受精和早期胚胎培养20192019年课标年课标，3838基因工程基因工程PCRPCR技术技术20182018年课标年课标，383820182018年年课标课标，3838基因工程基因工程基因工程基因工程，细胞工程，细胞工程基因工程的操作程序基因工程的操作程序基因工程的工具和操作程序，克基因工程的工具和操作程序，克隆技术隆技术20172017年课标年课标，3
2、83820172017年课标年课标，3838基因工程基因工程，动物细胞工程动物细胞工程基因工程基因工程基因工程的工具和操作程序，基因工程的工具和操作程序，动物细胞培养动物细胞培养基因工程的工具和操作程序基因工程的工具和操作程序20162016年课标年课标，40 40 20162016年课标年课标，4040基因工程基因工程基因工程基因工程基因工程的工具和操作程序，基因工程的工具和操作程序，基因工程的操作工具分析基因工程的操作工具分析考情分析考情分析 基因工程基因工程 基因工程基因工程=基因拼接技术基因拼接技术=DNA重组技术重组技术 是指是指按照人们的愿望按照人们的愿望，进行严格的，进行严格的设
3、设计计，并通过，并通过体外体外DNADNA重组和转基因重组和转基因等技术，等技术，赋予生物以赋予生物以新的遗传特性新的遗传特性，从而创造出，从而创造出更更符合人们需要的新的生物类型和生物产品符合人们需要的新的生物类型和生物产品。操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平技术手段技术手段结果结果优点优点变异类型变异类型生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平体外体外DNA重组和转基因技术重组和转基因技术人类需要的生物类型和生物产品人类需要的生物类型和生物产品定向改变生物性状定向改变生物性状打破物种之间的界限打破物种之间的界限基因重组基因重组剪刀剪刀针线针线运输车运输车限制限制限制限制
4、性核性核性核性核酸内酸内酸内酸内切酶切酶切酶切酶DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶运载体运载体运载体运载体1.1.限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）来源种类 作用特点作用结果主要主要从原核生物中分离纯化而来从原核生物中分离纯化而来已经分离出大约已经分离出大约4000种种1.识别双链识别双链DNA分子的某种分子的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列2.使每一条链中特定部位的使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间两个核苷酸之间的的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。形成形成黏性末端黏性末端或或平末端平末端具有特异性（具有特异性（识别序列特异和切割位置特异识别序列特异和切割位置
5、特异）阅读课本阅读课本4-54-5页页“限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶分子手术刀分子手术刀”的的相关内容，完成下表相关内容，完成下表 被切割部位一般被切割部位一般具有具有回文序列回文序列，即在，即在切割部位，一条链切割部位，一条链（GAATTCGAATTC）正向读的）正向读的碱基顺序与另一条链碱基顺序与另一条链(CTTAAG)(CTTAAG)反向读的顺反向读的顺序完全一致。序完全一致。中轴线中轴线限制酶的识别序列限制酶的识别序列A A在该在该DNADNA分子中，分子中，a a酶与酶与b b酶的识别序列分别有酶的识别序列分别有3 3个和个和2 2个个B Ba a酶与酶与b b酶切出的黏性末端不
6、能相互连接酶切出的黏性末端不能相互连接C Ca a酶与酶与b b酶切断的化学键不同酶切断的化学键不同D D只仅用只仅用b b酶切割，则得到酶切割，则得到3 3个个DNADNA分子产物分子产物 1.1.某某环状环状DNADNA分子分子含有含有30003000个碱基对个碱基对(bp)(bp)，先先用限制酶用限制酶a a切割，切割，再再把得到的产物用限制酶把得到的产物用限制酶b b切割，得到的切割，得到的DNADNA片段大小如下表。限制酶片段大小如下表。限制酶a a和和b b的识别序列和切割位点如下图所示。的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法正确的是（下列有关说法正确的是（）酶酶a切割切割产
7、物物(bp)酶酶b再次切割再次切割产物物(bp)1600；1100；300800；300A A难点难点1 1：限制酶的作用特点：限制酶的作用特点类型类型来源来源功能功能相同点相同点差别差别EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体催化形催化形成成磷酸磷酸二酯键二酯键只能连接黏性末端只能连接黏性末端能连接能连接黏性末端黏性末端和和平末端平末端(效率较低效率较低)2.2.分子缝合针分子缝合针DNADNA连接酶连接酶作用前提：两作用前提：两DNADNA片段要具有片段要具有互补的黏性末端互补的黏性末端才能拼起来。才能拼起来。名称名称作用部位作用部位作用结果作用结
8、果限制酶限制酶磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNA切成片段切成片段DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键将两个将两个DNA片段连接为一个片段连接为一个DNA分子分子DNA聚合酶聚合酶磷酸二酯键磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解水解)酶酶磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶解旋酶碱基对之间的氢键碱基对之间的氢键将双链将双链DNA分子局部解旋为单链，形分子局部解旋为单链，形成两条长链成两条长链难点难点2 2：与：与DNADNA相关的五种酶的比较相关的五种酶的比较GC T T A A A A T T C
9、 GG C T T A A A A T T C GG A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GDNADNA连接酶连接酶难点难点3 3：限制酶和：限制酶和DNADNA连接酶综合运用连接酶综合运用切取目的基因与切割载体时不切取目的基因与切割载体时不一定使用一定使用“同一种酶同一种酶”难点难点3 3：限制酶和：限制酶和DNADNA连接酶综合运用连接酶综合运用可以防止酶切产物自身环可以防止酶切产物自身环化以及保证目的基因和质化以及保证目的基因和质粒正确相连。粒正确相连。2.2.（20162016江苏单科，江苏单科
10、，3333节选）下表是几种限制酶识别序列及其切割节选）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图位点，图1 1、图、图2 2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：同的酶不重复标注。请回答下列问题：（3 3）若）若BamHIBamHI酶切的酶切的DNADNA末端与末端与BclIBclI酶切的酶切的DNADNA末端连接，连接部位末端连接，连接部位的的6 6个碱基对序列为个碱基对序列为 ，对于该部位，这两种酶，对于该部位，这两种酶 （填填“都能都能”、“都不能都不能”或或“只有一种能只有一种能”）切开。）切开。难点难点
11、3 3：限制酶和：限制酶和DNADNA连接酶综合运用连接酶综合运用GGATCAGGATCACCTAGTCCTAGTTGATCTGATCC CACTAGACTAGG G载体的作用载体的作用载体的必载体的必要条件要条件载体的种类载体的种类3.3.分子运输车分子运输车运载体运载体1 1）有一至多个有一至多个有一至多个有一至多个限制酶切点限制酶切点，供，供，供，供外源外源DNA片段插入其片段插入其中中。2 2）能能在在在在宿主细胞中进行宿主细胞中进行自我复制自我复制，或整合到染色体，或整合到染色体DNA上，上，随染色体随染色体DNA进行同步复制进行同步复制。3 3）具有特殊的）具有特殊的）具有特殊的）
12、具有特殊的标记基因标记基因，供重组，供重组，供重组，供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。的鉴定和选择。的鉴定和选择。1 1）作为）作为）作为）作为运输工具运输工具，将目的基因导入受体细胞中，将目的基因导入受体细胞中，将目的基因导入受体细胞中，将目的基因导入受体细胞中2 2）在受体细胞内对目的基因进行）在受体细胞内对目的基因进行）在受体细胞内对目的基因进行）在受体细胞内对目的基因进行大量复制。大量复制。质粒、质粒、噬菌体衍生物噬菌体衍生物噬菌体衍生物噬菌体衍生物、动植物病毒等。、动植物病毒等。实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天
13、然质粒的基础上进行过质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造人工改造的。的。载载体体上上的的标标记记基基因因一一般般是是某某种种抗抗生生素素的的抗抗性性基基因因，而而受受体体细细胞胞没有抵抗该抗生素的能力。没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，使体细胞内表达，使受体细胞对该抗生素产生抗性。受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了含该抗生素抗性基因载体的受的培养基上，能够生存的是被导入了含该抗生素抗性基因载体的受体细胞。体细胞。难点难点4
14、4：标记基因的筛选原理：标记基因的筛选原理3.（2016课标课标，4040节选节选）某一质粒载体如图所示，外源）某一质粒载体如图所示，外源DNA分子分子插入到插入到Ampr或或Tetr中会导致相应的基因失活（中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素表示氨苄青霉素抗性基因，抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌
15、。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：菌。回答下列问题：难点难点4 4：标记基因的筛选原理：标记基因的筛选原理（2）如果用含有）如果用含有氨苄青霉素氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是因的细胞不能区分的，其原因是；并且；
16、并且和和的细胞也是不能区分的，其原因是的细胞也是不能区分的，其原因是。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有的固体培养基。的固体培养基。（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体质粒载体含有插入了目的基因的含有插入了目的基因的重组质粒（或重组质粒）重组质粒（或重组质粒）二者均含二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长基上均能生长四环素四环素 1.已知某种限制性核酸内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切割后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是()A3 B4 C9 D12C C课堂练习课堂练习
