食品分析教学课件14食品病原微生物检测

第十四章第十四章 食品病原微生物检测食品病原微生物检测一、食品病原微生物的定义一、食品病原微生物的定义二、生化检测法二、生化检测法三、分子生物检测技术三、分子生物检测技术 主要内容主要内容食品病原微生物的定义食品病原微生物的定义1.1.定义定义:凡侵入人体可以引起感染甚至传染病的微生物统称凡侵入人体可以引起感染甚至传染病的微生物统称为病原微生物，或称病原体。以细菌和病毒的危害性最大。为病原微生物，或称病原体。以细菌和病毒的危害性最大。2.2.病原微生物污染食品的途径主要有食品原料污染、加工不病原微生物污染食品的途径主要有食品原料污染、加工不卫生、加工交叉污染、杀菌不彻底、保存不当等。卫生、加工交叉污染、杀菌不彻底、保存不当等。3.3.可靠的病原微生物检测方法是控制和预防食源性疾病关键可靠的病原微生物检测方法是控制和预防食源性疾病关键环节之一。环节之一。上海甲肝大爆发上海甲肝大爆发事件：事件：发生于发生于1988年春季，上海市市民食用受到甲肝病毒污年春季，上海市市民食用受到甲肝病毒污染的毛蚶引起，此次疫情共造成超过染的毛蚶引起，此次疫情共造成超过30万人感染和万人感染和31人死亡，人死亡，一度引起社会恐慌。一度引起社会恐慌。毛蚶（毛蚶（han）吃法吃法 :毛蚶在开水里浸一下，蘸上调料食用，毛蚶在开水里浸一下，蘸上调料食用，味道鲜美。味道鲜美。1.1.一种单链的核糖核酸病毒，病毒抗高温、酸碱的能力非常一种单链的核糖核酸病毒，病毒抗高温、酸碱的能力非常高。高。2.2.与其它病毒性肝炎相比甲型肝炎比较缓和，不会导致肝脏与其它病毒性肝炎相比甲型肝炎比较缓和，不会导致肝脏长期被破坏。长期被破坏。甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒电镜图甲型肝炎病毒电镜图禽流感禽流感1.1.流行性感冒病毒（流行性感冒病毒（influenza virusinfluenza virus），简称流感病毒，包括人流感病毒和动），简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒。物流感病毒。2.2.流感病毒分为甲（流感病毒分为甲（A A）、乙（）、乙（B B）、丙（）、丙（C C）三型，是流行性感冒（流感）的病）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如1918191819191919年的大流行中，全世界至少有年的大流行中，全世界至少有20002000万万40004000万人死于流感。万人死于流感。3.3.高致病性病毒包括高致病性病毒包括H5N1H5N1和和H7N9H7N9，H H代表血凝素；代表血凝素；N N代表神经氨酸酶代表神经氨酸酶流感病毒在人与动流感病毒在人与动物之间的传播物之间的传播一、食品病原微生物及其危害一、食品病原微生物及其危害我我国国食食物物中中毒毒的的高高危危食食品品为为：肉肉类类、粮粮食食、海海产产品品、水水果果蔬蔬菜菜、鸡鸡蛋蛋、豆豆类类和和奶制品。奶制品。蛋及蛋制品：蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌链球菌、副溶血性弧菌乳制品：乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌畜禽肉类：畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌肠道致病菌和致病性球菌米面类：米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等罐头：罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌 1.1.我国致病性微生物引起的食源性疾病现状表明，由肠道致病菌污染我国致病性微生物引起的食源性疾病现状表明，由肠道致病菌污染食品而引起的食物中毒以及疾病散发是直接造成人体健康损害的主食品而引起的食物中毒以及疾病散发是直接造成人体健康损害的主要食源性危害。要食源性危害。2.2.沙门氏菌中毒一直居我国微生物性食物中毒的首位，但近两年在沿沙门氏菌中毒一直居我国微生物性食物中毒的首位，但近两年在沿海地区和部分内地省区，海地区和部分内地省区，副溶血性弧菌中毒已跃居沙门氏菌之上副溶血性弧菌中毒已跃居沙门氏菌之上食品病原微生物及其危害食品病原微生物及其危害沙门氏菌沙门氏菌 沙门氏菌属：革兰氏阴性，杆菌，周生鞭毛、无芽孢，能以柠檬酸盐为唯一碳源，多数能产气，种类繁多。已发现2000多个种（或血清型）。美国兽医微生物和病理学家，是美国授予的第一位兽医学博士。DANIEL ELMER SALMON,(1850-1914)沙门氏菌沙门氏菌1.1.沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，菌性的食物中毒中，沙门氏菌常居前列沙门氏菌常居前列。因此，沙门氏菌的。因此，沙门氏菌的检测是各国检验机构对多种进出口食品的检测是各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一必检项目之一。2.2.引起食物中毒最常见的菌型有猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门引起食物中毒最常见的菌型有猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等约氏菌、肠炎沙门氏菌等约20种。种。3.3.其最适温度为其最适温度为2030是种可存活是种可存活23周，但对热敏感周，但对热敏感100立立即死亡。即死亡。沙门氏菌沙门氏菌李斯特氏菌李斯特氏菌1.1.李斯特菌李斯特菌,又名单核细胞增生性李斯特菌、李氏菌，是一种兼性又名单核细胞增生性李斯特菌、李氏菌，是一种兼性厌氧细菌。厌氧细菌。2.2.李斯特菌是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门。它在李斯特菌是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门。它在30 oC以下的环境以下的环境中具能动性，但通常不耐超过中具能动性，但通常不耐超过37 oC的高温。的高温。3.3.主要以食物为传染媒介，是主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一最致命的食源性病原体之一，造成，造成二至三成的感染者死亡。二至三成的感染者死亡。大肠杆菌O157:H7型1.1.是一种肠道出血性大肠杆菌，是食物中毒的原因之一。是一种肠道出血性大肠杆菌，是食物中毒的原因之一。2.2.革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛。3.3.最适生长温度为最适生长温度为33-4233-42，3737繁殖迅速，繁殖迅速，44-4544-45生长不良，生长不良，45.545.5停止生长，停止生长，75 175 1分钟即被灭活。分钟即被灭活。4.4.感染者通常发生出血性腹泻，尤其在儿童和年长者中，有时导感染者通常发生出血性腹泻，尤其在儿童和年长者中，有时导致肾衰竭。致肾衰竭。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌1.1.金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。性。2.2.金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度氧或兼性厌氧，最适生长温度37oC，干燥环境下可存活数周干燥环境下可存活数周。3.3.曾出现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（超级细菌），除了万古霉曾出现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（超级细菌），除了万古霉素，几乎能抵抗人类所有的药物素，几乎能抵抗人类所有的药物。金黄色葡萄球菌毒性金黄色葡萄球菌毒性 金黄色葡萄球菌致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：1.溶血素：外毒素，分、四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；2.杀白细胞素：可破坏人的淋巴细胞和巨噬细胞；3.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；4.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。副溶血性弧菌副溶血性弧菌1.1.副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。类和海藻等海产品。2.2.革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多副溶血弧菌形态杆菌革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多副溶血弧菌形态杆菌3.3.温度为温度为30373037，含盐，含盐2.5%3%(2.5%3%(若盐浓度低于若盐浓度低于0.5%0.5%则不则不生长），生长），pHpH值为值为8.08.58.08.5。本菌对酸较敏感，当。本菌对酸较敏感，当pH6pH6以下即以下即不能生长，在普通食醋中几分钟即死亡。不能生长，在普通食醋中几分钟即死亡。二、微生物检测方法二、微生物检测方法1.食品微生物微生物检测方法主要包括生化检测法和分子生物学检测2.生化检测法：利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种。代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种。3.分子生物学检测:是针对病原微生物的核酸分子特征进行菌是针对病原微生物的核酸分子特征进行菌种分类。种分类。技术特点技术特点1.1.生化检测法：是常规的检测方法，缺点是费时费力，且生化检测法：是常规的检测方法，缺点是费时费力，且只能检测活菌的总数，对某些特定的病原菌和污染菌无只能检测活菌的总数，对某些特定的病原菌和污染菌无法实现定性和定量。法实现定性和定量。2.2.分子生物学检测法：技术发展迅速，灵敏、省时，准确，分子生物学检测法：技术发展迅速，灵敏、省时，准确，可实现自动化和标准化。检测的方法包括：凝胶可实现自动化和标准化。检测的方法包括：凝胶PCRPCR法、法、荧光定量荧光定量PCRPCR法和基因芯片检测法等。法和基因芯片检测法等。25g样品样品+225ml 生理盐水生理盐水 5mL样品匀液（样品匀液（1:10）+50mL7.5%NaCl肉汤肉汤血平板血平板36 1 24hr 镜镜 检检 营养肉汤营养肉汤血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验 报告结果报告结果 36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 6hr BP平板平板金黄色葡萄球金黄色葡萄球菌检测流程菌检测流程检测步骤检测步骤-增菌增菌利用金黄色葡萄球菌利用金黄色葡萄球菌耐盐耐盐的特性（可耐受的特性（可耐受15%的氯化钠），的氯化钠），用含用含7.5%氯化钠肉汤进行培养。氯化钠肉汤进行培养。检测步骤检测步骤 -血平板血平板蛋白胨和牛肉粉主要提供细菌生长所需要的碳源、氮源、氨蛋白胨和牛肉粉主要提供细菌生长所需要的碳源、氮源、氨基酸及维生素。氯化钠维持培养基中的渗透压，琼脂用做凝基酸及维生素。氯化钠维持培养基中的渗透压，琼脂用做凝固剂。脱纤维羊血一方面提供一些特殊的生长因子，另一方固剂。脱纤维羊血一方面提供一些特殊的生长因子，另一方面用于观察溶血反应面用于观察溶血反应。原理：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产原理：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。生明显的溶血环。血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。血平板血平板检测步骤检测步骤-BP-BP平板平板1.1.胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素痕量矿物元素2.2.金黄色葡萄球能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色，易金黄色葡萄球能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色，易于观察于观察3.3.卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环BP平板平板检测步骤检测步骤-鉴定鉴定大多数致病性金黄色葡萄球菌能产生一种血浆凝固大多数致病性金黄色葡萄球菌能产生一种血浆凝固酶（游离血浆凝固酶），能加速人或兔血浆的凝固，酶（游离血浆凝固酶），能加速人或兔血浆的凝固，保护病原菌不被吞噬或免受抗体等的作用。保护病原菌不被吞噬或免受抗体等的作用。1.1.吸取新鲜兔血浆吸取新鲜兔血浆0.5