免疫学课件免疫实验一

医学免疫学实验医学免疫学实验 一、凝集试验 吞噬试验二、沉淀试验 溶血反应三、免疫标记技术；免疫细胞的分离；细胞免疫功能测定实验一实验一（一）（一）凝集试验凝集试验 1、直接凝集反应（、直接凝集反应（ABO血型鉴定）血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（二）（二）吞噬试验吞噬试验（示教）（示教）（310室）室）1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）（一）凝集试验 1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（什么是凝集试验或直接、间接、协同凝集试验？）免疫学检测技术免疫学检测技术利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。一、一、抗原抗体的检测抗原抗体的检测凝集试验二、二、免疫细胞功能的检测免疫细胞功能的检测吞噬试验三、其他，如细胞因子的检测三、其他，如细胞因子的检测如何检测抗原或抗体？（基本原则）抗原抗原 抗体抗体 抗原抗体反应现象抗原抗体反应现象 （抗原抗体结合反应的高度特异性）？抗体抗体 抗原抗原?有现象（有相应抗原）（有相应抗原）无现象（无相应（无相应 抗原）抗原）有反应现象（有相应（有相应 抗体抗体)无反应现象（无相应抗体（无相应抗体）抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例：抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例：（形成可见的大抗原抗体复合物合适条件：）（形成可见的大抗原抗体复合物合适条件：）AgAb AgAb AgAb AgAbAbAbAbAgAg、Ab比比例合适：例合适：AgAb：AgAb：AgAbAb Ab，游离，游离AbAbAgAg，游离，游离Ag(visible)（凝集或沉淀）(unvisible)8Equivalence Lattice formationAb excessAg excess(Visible)9Antigen addedAntibody excess zoneEquivalence zoneAntigen excess zoneImmune complex 【凝集反应凝集反应】：（1）概念：）概念：颗粒性颗粒性AgAb （凝集块）凝集块）可溶性可溶性AgAb （沉淀物）沉淀物）AgAb AgAbAbAgAbAb（凝集反应）（凝集反应）（细菌、细胞）（细菌、细胞）AgAb AgAbAbAg（蛋白质、多糖）（蛋白质、多糖）Ab（沉淀反应）（沉淀反应）颗粒性颗粒性AgAb 凝集块（直接凝集反应）凝集块（直接凝集反应）可溶性可溶性Ag载体载体 Ab 凝集块凝集块（间接凝集反应）（间接凝集反应）（细胞、细菌等）细胞、细菌等）（正向间接凝集反应正向间接凝集反应）可溶性可溶性Ag 载体载体Ab 凝集块（凝集块（反向间接凝集反应反向间接凝集反应）Ag 金葡菌金葡菌Ab 凝集块（协同凝集反应）凝集块（协同凝集反应）一定条件一定条件（2）类型）类型（致敏载体（致敏载体?）（3）凝集试验检测原理颗粒性颗粒性AgAb 凝集块（直接凝集反应）凝集块（直接凝集反应）？已知已知Ab Ag 金葡菌金葡菌Ab 凝集块（协同凝集反应）凝集块（协同凝集反应）？金葡菌已知金葡菌已知Ab 凝集（有对应凝集（有对应Ag）无凝集（无对应无凝集（无对应Ag）一定条件一定条件一定条件一定条件凝集（有对应凝集（有对应Ag）无凝集（无对应无凝集（无对应Ag）一定条件一定条件（一）（一）1、ABO血型鉴定血型鉴定直接凝集反应：直接凝集反应：颗粒性抗原颗粒性抗原 +抗体抗体 凝凝集块集块 RBC 抗抗A或抗或抗B 凝集块凝集块 血型血型 RBC抗原抗原 抗抗A 抗抗B A A抗原抗原 B B抗原抗原 AB 有有A、B O 无无A、B 实验步骤：实验步骤：1、制备红细胞悬液。、制备红细胞悬液。2、加抗、加抗A或抗或抗B。3、加红细胞悬液。、加红细胞悬液。4、结果观察。、结果观察。（2人/组）Bilateralis of the ring finger tip（一）（一）2、血清类风湿因子测定、血清类风湿因子测定正向间接凝集反应、血球凝集试验：正向间接凝集反应、血球凝集试验：可溶性可溶性Ag载体载体 Ab 凝集凝集 人人IgG-红细胞红细胞 类风湿因子类风湿因子 （致敏红细胞）（致敏红细胞）（待测）（待测）（半定量）（半定量）（效价）（效价）效价（滴度）：效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应以出现明显抗原抗体反应现象（及以上）的最高稀释度作为待检现象（及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。1.稀释液稀释液 50l 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve2.待检血清待检血清（1：10）（Ab?）50ul Ab稀释度稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560弃去509 10 50ul 50 50 50 50 50 5050ul1.稀释液稀释液 50l 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve2.待检血清待检血清（1：10）（Ab?）50 3.加加Ag 50l 50 50 50 50 50 50 50 50ul 50 Ab最终稀释度最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:51204.现象现象 （效价）（效价）1:320 +-1:160 1:40 +-1:40 5.效价效价1：40，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560弃去5050ul +-+可能结果可能结果1：第1孔 2 3 4 5 6 7 8 9 10+Result 1:+Agglutination deposition -vecontrol+vecontrol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 +-standards to judge agglutination:+all the red blood cells agglutinate+most red blood cells agglutinate+half red blood cells agglutinate no agglutination all,agg.most,agg.half,agg.few,agg.no agglutination+-（+）（+）all,agg.most,agg.half,agg.few,agg.no agglutination+-+1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120titer is 1:640;So,titer 1:40,Test sample(sample serum)is positive.Rheumatoid factor is positive.Rheumatoid factor is at relatively high concentration.Agglutination deposition(result 1)+-+1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120maybe,titer is 1:5120,or 1:5120,So,titer 1:40,Test sample(sample sera)is positive.Rheumatoid factor is positive,in high level.Agglutination deposition(result 2)+-+1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120titer is?,(titer 1:40,or titer 1:40?)Test sample(sample serum,rheumatoid factor)is positive or negative?Agglutination deposition(result 3)Titer：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination(+)is called the titer.Titer：The highest dilution of the serum capable of agglutinating half of the red blood cells(+)is the agglutination titer.The results are also reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination.27 So,Titer,1:320(or 320),Titer,1:160(or 160),Titer,1:20(or 20),28 If Titer 1:40(or 40),positive(Ab positive)If Titer 1:40(or 40),negative(Ab negative)Titer,1:320(or 320),1:40(40),rheumatoid factor positiveTiter,1:160(or 160),1:40(40),rheumatoid factor positiveTiter,1:20(or 20),1:40(40),rheumatoid factor negative29（一）（一）3、协同凝集试验、协同凝集试验 金葡菌金葡菌 SPA 已知抗体已知抗体 （致敏金葡菌致敏金葡菌 ）Ag 金葡菌金葡菌Ab 凝集块凝集块(协同凝集反应协同凝集反应)请按照实验指导讲义方法进行操作；请按照实验指导讲义方法进行操作；注意观察第注意观察第1格内的凝集现象，并分析第格内的凝集现象，并分析第2、3格为何不出现凝集。格为何不出现凝集。1.Ab-s.aureus Ab-s.aureus s.aureus 2.CSF(Ag)normal saline CSF(Ag)3.joggle,4.(result)agglutinate CSF:cerebrospinal fluid from the patient with meningitis,There are meningococcuses(Ag)in CSF from the patient with bacterial meningitis.(two persons each group)先做类风湿因子测定先做类风湿因子测定微量移液器的使用微量移液器的使用How to Use a MicropipettorSet the desired volume by turning the centrally located rings.(Never exceed the upper or lower limits of pipettors.20200ul)Place a tip on the discharge end of the pipettor.Depress the plunger until you feel the initial resistance and insert tip into the solution,just barely below the surface of the liquid and not as deep as pos