免疫学课件免疫实验三

病原生物学和免疫学实验（免疫学实验）实验三 免疫标记技术 病原生物学与免疫学实验（免疫学实验）一、凝集试验、吞噬试验二、沉淀试验、溶血反应三、免疫标记技术、细胞免疫功能测定、豚鼠过敏试验四、小鼠脾NK细胞活性测定五、科研训练（一）六、科研训练（二）实验三实验三（一）免疫标记技术（一）免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法）、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法）2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验（二）免疫细胞功能测定（二）免疫细胞功能测定 1、E玫瑰花环试验（示教）玫瑰花环试验（示教）2、淋巴细胞转化试验（示教）、淋巴细胞转化试验（示教）（三）豚鼠过敏试验（录像）（三）豚鼠过敏试验（录像）（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）待检标本待检标本 阴性对照阴性对照 空白对照空白对照 （样品稀释液（样品稀释液100ul）“ELISA双抗体夹心法”，第5步，最后5孔，加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）2孔，每孔100ul，37，30分钟：8 9 10 11 12（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同稀释度（浓度）TNF-标准品，每孔100ul，37，30分钟：TNF-100ul 100 稀释液 100 100 100 100 100 100弃去弃去100 100ul 100 100 100 100 TNF-1000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 浓度(pg/ml)1 2 3 4 5 6 7 (倍比稀释)“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同浓度TNF-标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）2孔；每孔100ul，37，30分钟：1.TNF 100l 100 2 稀释液稀释液 100 100 100 100 100 100弃去100 100ul 100 100 100 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 TNF-(pg/ml)待检标本待检标本 阴性对照阴性对照 空白对照空白对照（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）How to Use a MicropipettorSet the desired volume by turning the centrally located rings.(Never exceed the upper or lower limits of pipettors.)(10100ul,20/40ul200ul)Place a tip on the discharge end of the pipettor.Depress the plunger until you feel the initial resistance and insert tip into the solution,just barely below the surface of the liquid and not as deep as possible.(for accurate/precise volume)1001 0 0 0100ul Carefully and slowly release plunger.(Allow the pipet tip to fill to final volume before removing it from solution to avoid the presence of bubbles in the plastic tip.)Discharge the solution into the appropriate container by depressing plunger.Remember to change tips between different solutions to avoid mixing or contaminating the solutions used.免疫学检测技术免疫学检测技术 利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。胞等免疫学研究对象的实验过程。一、一、抗原抗体的检测抗原抗体的检测凝集试验,沉淀试验,免疫标记技术二、二、免疫细胞的检测免疫细胞的检测吞噬试验,T/B细胞检测三、其他，如细胞因子的检测三、其他，如细胞因子的检测回顾概念：1 1、抗原，抗原，AgAg能诱导免疫系统产生特异性免能诱导免疫系统产生特异性免疫应答的异物。疫应答的异物。2 2、抗体，抗体，AbAb特异性蛋白质，由抗原诱导，特异性蛋白质，由抗原诱导，通过特异性免疫应答产生。与抗原一一对应通过特异性免疫应答产生。与抗原一一对应3 3、抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性4 4、免疫系统与免疫应答、免疫系统与免疫应答 免疫应答，特异性免疫应答免疫应答，特异性免疫应答 免疫系统清除异物的过程免疫系统清除异物的过程（抗体）如何检测抗原或抗体？（基本原则）如何检测抗原或抗体？（基本原则）抗原抗原 抗体抗体 抗原抗体反应现象抗原抗体反应现象 （抗原抗体结合反应具有高度特异性）？抗体抗体 抗原抗原?有现象（有相应抗原）（有相应抗原）无现象（无相应抗原）（无相应抗原）有反应现象（有相应（有相应抗体）抗体）无反应现象（无相应抗体（无相应抗体）抗原抗体反应的可见性：抗原抗体反应的可见性：AgAb AgAb AgAb AgAbAbAbAbAgAg、Ab比比例合适：例合适：AgAb：AgAb：AgAbAb Ab，游离，游离AbAbAgAg，游离，游离Ag(visible)（凝集或沉淀）(unvisible)抗原抗体的检测技术抗原抗体的检测技术 凝集试验 沉淀试验 蛋白质芯片技术 免疫标记技术：荧光免疫技术 酶免疫技术ELISA（双抗体双抗体夹心法心法）放射免疫技术 金免疫技术斑点免疫斑点免疫层析析试验 化学发光免疫技术等 （一）免疫标记技术（一）免疫标记技术【概念或原理概念或原理】：利用荧光素、酶、胶体金、发光物质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或抗体的量或其存在与否。优点：高度的敏感性和特异性，简便、优点：高度的敏感性和特异性，简便、快速，可作定性、定量或定位测定。快速，可作定性、定量或定位测定。【分类分类】荧光免疫技术 酶免疫技术ELISA（双抗体双抗体夹心法心法）放射免疫技术 金免疫技术斑点免疫斑点免疫层析析试验 化学发光免疫技术等 Ag Ab 荧光素荧光素AgAb荧光素荧光素 Ab 荧光素荧光素（？）（？）Ab荧光素荧光素（洗涤）免疫标记技术举例：（细胞表面可见荧光）17 cells with fluorescencetubercle bacillus with fluorescence20 酶免疫组化技术：组织（或细胞）中抗原定位 酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体ELISA(酶联免疫吸附试验，enzyme-linked immunosorbent assay)sandwich ELISA to detect Ag indirect ELISA to detect Ab competitive ELISA to detect Ag or Ab（一）免疫标记技术免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验(ELISA)酶免疫技术 1 1）已知抗体包被）已知抗体包被 2 2）洗板）洗板 3 3）加待检抗原标本）加待检抗原标本 4 4）洗板）洗板 5 5）加酶标记抗体）加酶标记抗体 6 6）洗板）洗板 7 7）加底物显色，测定）加底物显色，测定 (measure color)22（显色）（显色）（不显色）（不显色）（定量）（定量）(no Ag)(Ag)polystyreneSandwich ELISA(to detect Ag,双抗体夹心法，原理)（封（封闭的意的意义）（一）免疫标记技术免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验(ELISA)-双抗体夹心法请按照实验指导讲义方法进行操作，第5-11步；第5、7步孵育时间由60min改为30min第5步按下页PPT的图加样，加12个孔，37，30分钟，（实验课开始时已做，接着做第6步，洗板）结果，作标准曲线，计算待检标本TNF-浓度“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同浓度TNF-标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）2孔；每孔100ul，37，30分钟：1.TNF 100l 100 2 稀释液稀释液 100 100 100 100 100 100弃去100 100ul 100 100 100 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 TNF-(pg/ml)待检标本待检标本 阴性对照阴性对照 空白对照空白对照（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）5.加待检标本：1-7孔加不同浓度TNF-标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）2孔；每孔100ul，37，30分钟。6.弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。7.每孔加100l酶标记抗TNF单克隆抗体，置37湿盒30min。8.弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。9.每孔加底物溶液100l，37避光孵育15min。10.每孔加终止液一滴（约50l），终止反应。11.观察显色反应，酶标仪在490nm处测定每孔OD值。12.作标准曲线，计算待检标本TNF-浓度。【线性关系式：log(concentration)=a*log(OD)+b】输入相应数据；选中相应数据；EXCEL2007绘制标准曲线步骤：在上方工具栏里选插入散点图，并选中第一个类型的散点图；EXCEL2007绘制标准曲线步骤：（得到下图：）选中插入的散点图，在工具栏里的图表布局里选中第三行最后一个；选中后可得到如下图表：线性关系式：log(concentration)=1.607*log(OD)+2.602，根据OD值计算待检标本TNF-浓度。30A 96-well microtiter plate.This plate could be used for ELISA 31(Indirect ELISA to detect Ab)32（一）（一）2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA)the rapid tests that you might use to detect pregnancy,or diagnose an infection quickly in a doctors office.34 B C T R A(Nitrocellulose membrane)金标抗体（免疫金复合物）（小鼠金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗）（抗HCG）特异性抗原（特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素），绒毛膜促性腺激素）固相特异性抗体（抗固相特异性抗体（抗HCG）固相抗小鼠固相抗小鼠IgG抗体抗体 阳性：阳性：T区、区、R（或（或C）区均出现红色）区均出现红色线条（两条红线）；线条（两条红线）；阴性：阴性：T区不出现红色线条，仅区不出现红色线条，仅R（或（或C）区出现红色线条（一条红线）。）区出现红色线条（一条红线）。3536 positive negative invalid（一）（一）2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验请按照实验指导讲义方法进行操作，请按照实验指导讲义方法进行操作，并判断结果，并判断结果，（二）免疫细胞功能测定 1、E花环试验 原理：T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体）(CD2)，若T细胞与绵羊红细胞共同孵育，T细胞周围吸附绵羊红细胞，为花环形成细胞，可