《生物制药技术》实验指导-实验二

生物制药技术实验指导生物制药技术实验指导实验二实验二 金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）实验目的：实验目的：1、学习和掌握无菌操作技术。2、掌握定向发酵四环素的原理。实验原理：实验原理：定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：R1R2ClHHOHHH金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。另外，金色链霉菌在 30以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35时则只合成四环素。本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入 2-硫醇基苯并噻唑(即 M促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。材料、试剂和器材：材料、试剂和器材：金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（菌种保藏号：CGMCC4.1043；订单号 20111133550 元）。超净工作台、摇床（250ml、500ml）酒精灯、酒精棉球、工业酒精、打火机、接种铲、移液枪、剪刀实验步骤：实验步骤：前期准备工作：配制孢子培养基麸皮 36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO47H2O0.1 g，（NH4）2HPO43 g，琼脂 1520 g，定容至 1L，pH 7。1金霉素土霉素四环素1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28下 200 r/min 振荡培养，将活化 1d 后的金霉素链霉菌种接入孢子培养基，28培养 57 天，待孢子长成灰色，于 4冰箱中保藏。2、种子培养：在斜面上用接种铲挑取1cm2左右生长良好的菌体接入装有 50ml 四环素种子培养基的 250ml 锥形瓶中，230 r/min、28下振荡培养 2024h。3、发酵培养：以剪口移液枪头取10 ml 种子液接入装有 100ml 发酵培养液的 500ml 锥形瓶中（注意注意：同一处理组用同一瓶种子液接种），230 r/min、28下振荡培养 5 d。用于后面的测定效价和薄层层析实验。四环素的提取和精制（选作）四环素的提取和精制（选作）一、实验目的1 掌握沉淀法精制四环素的原理、方法和基本操作技术。2 熟悉 pH 的控制与产量、质最的关系。二、实验原理四环素为两性化合物，其等电点为 5.4。当溶液 pH 等于等电点时，四环素呈游离碱形式，从水溶液中沉淀出来。利用四环素的这一性质，可将四环素从发酵液中提取出来。在连续结晶过程中，pH 的高低对产量、质量都有一定的影响。四环素的等电点为5.4,在 pH 4.57.5 之间，游离碱在水中的溶解度乎不变。若pH 控制在接近等电点时，沉淀结品虽然比较完全，收率也高，但此时会有大量杂质同时析出，影响产品的色泽和质量；若pH 控制得较低一些，对提高产品质量虽有好处，但沉淀结晶不够完全，收率会低些，影响产量。因此，在选择沉淀结晶 pH 时，就必须同时考虑到产量、质量的效果。在正常情况下，工艺上控制 pH4.8 左右。若沉淀结晶质量较差，pH 可控制得稍低些，有利于结晶质量的改善，但不能低于 4.5，否则收率低，影响产量。四环素的提取和精制分酸化、纯化、过滤、结晶和淋洗五个步骤。(1)酸化 加入草酸，使积聚在菌丝体内的四环素尽可能多地成为可溶性盐，而转入液相。四环素在酸性条件下较隐定，且草酸与钙离子反应生成不溶性的草酸钙，析出的草酸钙能促进蛋白质的凝固，提高滤液的纯度和过滤速度。(2）纯化 纯化剂（黄血盐、硫酸锌和硼砂）与草酸一起混合作用，可以除去发酵液中大量酸溶性蛋白质、铁离子和其他多种离子色素以及其他杂质，从而使滤液纯净，并减少发酵液的粘度，利于过滤。其中纯化剂黄血盐能与发酵液中的铁离子作用，生成普鲁士盐而除去铁离子。(3）过滤 通过过滤，使四环素溶液与菌丝体以及其他杂质分离，再经过复滤、精滤，进一步提高滤液质址，得到澄清的滤液。(4)结晶将滤液的 pH 调节到等电点，在较低温度下析出纯净的四环素。(5）淋洗 虽然发酵液经酸化后大部分四环素已溶入溶液中，但仍有部分残存在菌渣中，且过滤不可能十分彻底。所以用酸水淋洗，以提高收率。三、实验材料及仪器1试剂300 g/L 草酸溶液、200 g/L 黄血酸钾溶液、200 g/L 硫酸锌溶液、200 g/L 硼砂溶液、浓氮水、3 g/L 草酸溶液。2仪器1000 mL 烧杯、搅拌器、布氏漏斗、抽滤瓶、滤纸、量筒、pH 试纸、酸度计、温度计、水2泵、表面皿。四、实验步骤1酸化取 600ml 四环素发酵液，置装有机械搅拌的1000 mL 烧杯中，开始搅拌，待发酵液温度降至 20 以下时，缓缓加入草酸溶液，草酸加入量为2735g/L，并不时测定发酵液的pH。当发酵液 pH 为 1.71.8 时（用酸度计测定），酸化完毕。2纯化在酸化反应的烧坏中，按酸化的发酵液净体积，搅拌下依次缓慢加入纯化剂（黄血酸钾溶液、硫酸锌溶液、硼砂溶液），每种溶液终浓度均为 2 g/L，加入时间间隔 15min，以便作用完全。3过滤将布氏漏斗装于抽滤瓶上，铺好滤纸，开启水泵，用少量水将滤纸湿润，并使滤纸紧贴布氏漏斗。将纯化后的溶液缓缓倒入布氏漏斗，过滤滤液应完全澄清，否则必须重新过滤，直到完全澄清。4.结晶将抽滤瓶中的滤液倒入装有机械搅拌的 1000 mL 烧杯中，开动搅拌，并用水或冰水冷却。待滤液温度冷至 5 7 时，徐徐加入经过滤的浓氨水，并随时用 pH 试纸测定溶液的 pH，当 pH 达到 4.6 4.8 时（用酸度计测定），停止加入氨水，并继续搅拌2 h，使结晶完全。装好布氏漏斗后，将上述液缓缓倒人布氏漏斗，过滤。结晶液全部倒入后，抽干。用3545 的热水充分洗涤粗碱 3 次，抽干，再用 0.3 草酸洗涤，抽干。五、注意事项1纯化搅拌时间不应少于2h，溶液温度保持在 15 以下。2pH 要调准确。六、结果与讨论1 计算四环素的得率。2 讨论影响四环素得率和纯度的因素。3