动物细胞转染知识大全

转染转染转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。转染方法的分类转染方法的分类对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子.根据转染的机制不同可划分为化学转染法和物理转染法两大类.化学转染法1.DEAE-葡聚糖法DEAE 葡聚是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用 DEAE-葡聚糖转染成功地用用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。2.磷酸钙法磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将 DNA 和氯化钙混合，然后加入到 PBS 中慢慢形成 DNA 磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入 DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA 免受降解.3.人工脂质体法人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及 RNA,和蛋白质。此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导 DNA 和 RNA 转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后 DNA 复合物被释放进入细胞核内，至于DNA 是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚。物理方法1.显微注射显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。2.电穿孔这种方法常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研究。电穿孔法常用来转染如植物园生智体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系。3.基因枪法基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞核在体内的细胞。罗氏推荐罗氏推荐 如何提高转染实验成功率如何提高转染实验成功率【组织培养试剂】【组织培养试剂】一般提示：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。基础培养基基础培养基目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640 和 DMEM）。培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物质，如 HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。酚红试剂酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES 降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。胎牛血清胎牛血清血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。因此血清易受显著生物学变异的影响。添加剂添加剂某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。COCO2 2培养箱培养箱细胞生长所需环境为 37、相对湿度为95的 CO2培养箱。用 CO2是为了控制 pH 值。细胞生理对 pH 的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。有些培养基需要 CO2浓度为 5来有效控制 pH 值，而另一些则需要 10的 CO2。需要向您的培养基供应者核对一下适当的 CO2浓度。如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和 CO2）则会导致实验结果的板间变异性。来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌细胞的污染也都可能影响到细胞生理。【细胞】【细胞】一般提示：密切观察您的细胞；确保它们状态良好。在开始转染细胞之前，先制定一个适当的种板方案，使细胞密度从转染开始到结束都保持最佳状态。增加成功几率增加成功几率细胞是转染过程中的一个关键元素，它可以是影响结果的一致性和质量的最重要的变量。分裂细胞相比较非分裂细胞分裂细胞相比较非分裂细胞分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源 DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于生长过度的状态。由于FuGENE 6 和 HD 转染试剂对于细胞作用温和，可同时进行贴壁细胞的种板和转染。此外，还常用促有丝分裂刺激物（如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞）来活化原代培养细胞。贴壁细胞相比较悬浮细胞贴壁细胞相比较悬浮细胞在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。天生趋于悬浮的细胞（如HL 60，Jurkat）非常难以转染；相反，天生为贴壁的细胞（如 HEK，CHO）则可适应悬浮生长的条件。那些天然悬浮的和那些适应悬浮的细胞的浆膜是不一样的。据推测转染过程中的一个限制步骤就是通过内吞作用摄取转染分子（DNA 或 RNA 与转染试剂的复合物）；然而，目前对此尚未有分子水平上的合理机制的解释。细胞间膜结构的差异可能是某些细胞类型天生难以转染的部分原因。所以，寻找更有效转染试剂的工作目前还主要是经验性的，尤其对于那些天生为悬浮的细胞而言更是如此。这常常是在不含血清而含有抑制转染的特殊添加剂的培养基中发生。经小心处理后，这些细胞可适应于在没有添加剂的环境中悬浮生长。如果这些适应于悬浮生长的贴壁细胞在没有这些添加剂的环境中生长，那么它们就可以被转染。分批方案分批方案在对培养细胞进行分批传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。因此分批方案的不同（如，胰蛋白酶消化时间的延长，胰蛋白酶的失活，以及消化后直到转染开始的时间）都可能对转染实验有所影响。如果在转染时细胞过于密集，那么种到培养板上的就会是细胞团块而非单个细胞。对于某些细胞试剂组合而言，浆膜状态被改变后有可能会影响到所用试剂和 DNA的最佳配用量和配比。传代次数传代次数传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度（通常在一个实验室范围内）。在某些情况下，自建立细胞系起的确切传代次数无法得知。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。培养条件的不同可引起克隆选择。因此名称相同的同一细胞系有关其生理学和形态学（以及转染能力）性质可能会有很大的差异。一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。在不同细胞系之间转染效率的变化很大。某些细胞系在传代很大次后仍能保持稳定的转染效率，而其他一些则传代很少次数就表现出转染效率的差异。细胞数量（汇聚度）细胞数量（汇聚度）只要培养基质（组织培养皿）尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制（接触抑制），但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及它们随后直到细胞溶解之前的生长情况相关。培养物污染培养物污染培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。支原体污染支原体污染支原体污染在所有培养细胞中的比例为 5-35，它可改变细胞生长特性，酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。特别是，支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰，其结果致使转染效率偏低或非典型。这些效应会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。和细菌及真菌不同，支原体污染无法通过视觉检查发现。它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜；它们还对常用抗生素有抗药性。所以必需进行支原体污染的常规筛查。交叉污染交叉污染如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。这种变化是逐渐发生的；而您可能甚至还未发现。建立细胞系鉴定的检测标准。例如，对于人类细胞系而言，STR（短串联重复序列）图谱就是一种可靠的鉴定方法。或者更简单的解决方案就是，当怀疑有交叉污染时，如果有可能，就换用新鲜的，传代次数少的细胞源。【载体【载体 DNADNA】一般提示：对您纯化所得的载体进行质量检查。确定支持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在对您细胞体系的参数进行测定时，一定要选用一种您已知具有功能的对照载体。载体的完整性载体的完整性种载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋中断、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。载体制备物载体制备物各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物（如 CsCl，内毒素）可能会影响转染效率。载体构造（启动子增强子载体构造（启动子增强子 ORIORI）转染体系通常用带有强病毒调节元件（如，RSV，CMV，和 SV40）的对照载体进行优化和比较。然而，病毒启动子增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40 体系可高效表达 large T 抗原（如，COS）；而在其他许多细胞系中，则是 CMV启动子更为有效。除此之外，各种CMV 载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。【转染方案】【转染方案】一般提示：建立一套适当的转染方案；首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂DNA的配比和形成复合物的数量进行优化。转染复合物的制备转染复合物的制备诸如转染试剂DNA 配比，离子强度，缓冲液 pH 值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒既可在无菌水又可在TE 缓冲液中稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。需要对试剂提供方给予一定的信赖；除非您有很好的理由支持您做出改变，否则就应当严格按照他们所推荐的转染方案。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物；如果制备复合物所使用的培养基含有血清，它就会对转染产生抑制。制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节，对于不同的转染试剂而言可能差别很大。转染试剂转染试剂DNADNA 配比配比（负载比）（负载比）所有的转染试剂都会在某一个试剂DNA 配比时最为有效。有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄；而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。为了寻找这种最佳配比往往会花费大量的时间和金钱。除了配比的重要性之外，所加入转染复合物量的多少也非常关键。形成转染复合物所用的稀释剂形成转染复合物所用的稀释剂对于多数试剂而言，很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基和盐溶液中形成。复合物数量复合物数量对转染细胞所用的转染试剂DNA 复合物的量也应当进行优化。如果用量太少，那么转染DNA 的表达就太弱；如果用量太多，则可能由于细胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表达。最佳用量通常都必须进行实验来确定。所需要的转染复合物用量与所用细胞的数量相关。转染细胞越少，所需复合物就越少。转染复合物的加入有两种替换方法可用来浆转染复合物加入转染细胞：1.将复合物浓缩液逐滴加入培养基，或者 2.将转染复合物先用培养基稀释，然后进行培养基更换操作。第一种方法更简便，而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性，所以会使结果的一致性更好。转染培养基转染培养基转染过程中所使用的培养基对转染效率可能会有正面或负面的影响。甚至对于基础培养基配方而言也是如此，尤其是在培养基中加入牛