酶活性浓度的测定技术概述课件

3 3荧光法和放射性核素法荧光法和放射性核素法:对于一些酶浓度很低的标本，可考虑改用灵敏度对于一些酶浓度很低的标本，可考虑改用灵敏度较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如，还原型的出酶的活性。例如，还原型的NAD(P)HNAD(P)H有强烈的荧光，有强烈的荧光，故所有以故所有以NAD(P)NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较少。少。4 4其他方法其他方法:二、酶活性浓度的测定二、酶活性浓度的测定 测定酶的催化活性浓度是临床酶学分测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用的方法，具有迅速、灵敏、成析最为常用的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。(一一)酶促反应进程酶促反应进程 (二二)酶活性浓度测定方法酶活性浓度测定方法 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度速度(v)(v)达到最大速度达到最大速度VmaxVmax，即在过量底物存在，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度 EE之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分为定时法度测定方法进行分类，可分为定时法(fixed(fixed time assay)time assay)和连续监测法和连续监测法(continuous(continuous monitoring assay)monitoring assay)两大类。两大类。1 1定时法定时法 这是早期测定酶活性浓度的方法这是早期测定酶活性浓度的方法。大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应平均速度。这类方法有多种命名，如应平均速度。这类方法有多种命名，如“取样法取样法”、“终点法终点法”或或“两点法两点法”。用定时法测定酶活性浓度，必用定时法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则会引起较作用时间要很精确，否则会引起较大误差。这种方法的优点是比较简大误差。这种方法的优点是比较简单，因测定时酶促反应已被终止，单，因测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反个酶促反应进程中是否都是零级反应。应。2 2连续监测法连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。酶活性浓度的方法称为连续监测法。2 2连续监测法连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应产物或连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。与定时法不同的是，这类方为连续监测法。与定时法不同的是，这类方法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。反应的整个过程。这类测定方法简单，优点是可将多点的这类测定方法简单，优点是可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。通常截取反应开始后较短的时间，就能应。通常截取反应开始后较短的时间，就能近似地建立这种反应量与反应时间的线性关近似地建立这种反应量与反应时间的线性关系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定。而异，必须用实验方法进行确定。连续监测法连续监测法 连续监测法测定结果常较定时法高，连续监测法测定结果常较定时法高，且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，因而测定结果也较取样法准确。很小，因而测定结果也较取样法准确。3 3平衡法平衡法 通过测定酶促反应开始至反应达通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法，称为终点来求出酶活性浓度的方法，称为终点法。与定时法不同的是，平衡法是在法。与定时法不同的是，平衡法是在酶促反应平衡期酶促反应平衡期(S(S或或PP不变不变)任何任何一点进行测定，无需终止反应。目前一点进行测定，无需终止反应。目前此法已少使用。此法已少使用。三、连续监测法测定酶活性浓度三、连续监测法测定酶活性浓度 随着科学技术的不断进步与发展，各随着科学技术的不断进步与发展，各种自动生物化学分析仪的广泛使用，连种自动生物化学分析仪的广泛使用，连续监测法已逐步取代定时法而成为临床续监测法已逐步取代定时法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。实验室测定酶活性浓度最常用的方法。(一一)连续监测法的种类连续监测法的种类1 1直接法直接法 2.2.间接法间接法 1 1直接法直接法 这类方法是在不终止酶促反应条件下，直这类方法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、变化如吸光度、荧光、旋光性、pHpH、电导率、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的一种。一种。利用利用NAD(P)HNAD(P)H在在340nm340nm处的吸光度的变化测定各种处的吸光度的变化测定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)HNAD(P)H在在260nm260nm波长和波长和340nm340nm波长处有吸收峰，而氧化型波长处有吸收峰，而氧化型NAD+NAD+NADP+NADP+只在只在260nm260nm波长处有吸收峰，这是因为分子中有波长处有吸收峰，这是因为分子中有腺嘌呤的缘故。腺嘌呤的缘故。340nm340nm波长处吸光度的变化可以反映波长处吸光度的变化可以反映反应体系中反应体系中NAD(P)HNAD(P)H量的增减。还可利用一类人工合量的增减。还可利用一类人工合成的所谓成的所谓“色素原色素原”底物，其本身为无色或微黄色，底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基苯酚和硝酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。2.2.间接法间接法 直接法虽然简单，但只有底物与产物直接法虽然简单，但只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。故至今也只有很少一部才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法进行测定。目前可采用两分酶能用直接法进行测定。目前可采用两类间接法进行酶学测定。类间接法进行酶学测定。一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂，一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂，这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。典型的例子是血清性。典型的例子是血清ChEChE的丁酰硫代胆碱测定法。的丁酰硫代胆碱测定法。另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法，另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。促反应和被测酶反应偶联起来。(二二)酶偶联反应酶偶联反应 最简单的酶偶联反应最简单的酶偶联反应(单底物反应且只单底物反应且只有一个工具酶有一个工具酶)模式为：模式为：被测定酶被测定酶(Ex)(Ex)催化的反应称为始发反应；催化的反应称为始发反应；产生被检测物质产物产生被检测物质产物C(C(如如NADH)NADH)的反应称为指的反应称为指示反应，相应的偶联酶示反应，相应的偶联酶(第二个酶第二个酶)酶称指示酶称指示酶酶(Ei(Ei)。如果一些酶促反应找不到合适的指示如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为：起来，此反应称为辅助反应。模式为：一般习惯将最后一个酶称指示酶一般习惯将最后一个酶称指示酶EiEi，其他外加，其他外加的酶称为辅助酶的酶称为辅助酶(Ea)(Ea)。个别情况还可能使用两。个别情况还可能使用两种或以上的辅助酶。将这一连串酶促反应称为种或以上的辅助酶。将这一连串酶促反应称为酶偶联体系。酶偶联体系。临床常规酶学分析所用的酶偶联法中，临床常规酶学分析所用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物NADHNADH或或NADPHNADPH于于340nm340nm处吸光度的变化速率，处吸光度的变化速率，可以很容易地监测指示酶反应。可以很容易地监测指示酶反应。用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一开始反应用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一开始反应就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在几个时相：一是预孵育期，反应一开始只存在底物几个时相：一是预孵育期，反应一开始只存在底物 A A，不存在指示酶的反应，在此时相中使存在于样品中的干不存在指示酶的反应，在此时相中使存在于样品中的干扰物质充分进行反应，将试剂中的扰物质充分进行反应，将试剂中的NADHNADH变为变为NAD+NAD+。二。二是延滞期，加入底物启动反应，在启动后的一段短时间是延滞期，加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物内，产物 B B开始出现并逐渐增加，处于较低水平，指示开始出现并逐渐增加，处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率VxVx，这，这一时期称为延滞期。随着产物一时期称为延滞期。随着产物B B增加到一定程度时，增加到一定程度时，ExEx和和 EiEi反应速率相同，达到了稳态期。此阶段反应速率相同，达到了稳态期。此阶段 340nm340nm波长处波长处吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗，反吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗，反应速度又复减慢。应速度又复减慢。设计或选择酶测定方法时，如用酶偶联法，延设计或选择酶测定方法时，如用酶偶联法，延滞期越短越好，测