人教版高中生物选修1-生物技术实践：血红蛋白的提取和分离课件

课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离1、含量：占细胞干重的、含量：占细胞干重的50以上，是细胞中含以上，是细胞中含量量最多的有机化合物最多的有机化合物。2、组成元素：、组成元素：C、H、O、N3、基本单位：氨基酸、基本单位：氨基酸蛋白质小知识蛋白质小知识氨基氨基 NH2COOH 羧基羧基HRC4、分子结构：、分子结构：氨基酸氨基酸 多肽多肽 蛋白质蛋白质 肽键：肽键：CONH5、相对分子质量：、相对分子质量：高分子化合物高分子化合物蛋白质小知识蛋白质小知识脱水缩合脱水缩合盘曲折叠盘曲折叠一、基础知识一、基础知识：（一）（一）蛋白质提取和分离原理蛋白质提取和分离原理（二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法）电泳法（三）缓冲液的作用（三）缓冲液的作用1、分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。或化学性质的生物大分子。2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？、蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。不同种类的蛋白质。思考思考凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖实例：葡聚糖、琼脂糖凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）2、原理：、原理：当当相对分子质量不同相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量对分子质量较小较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度道，路程较长，移动速度较慢较慢；而相对分子质量；而相对分子质量较大较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快较快。相对。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对相对分子质量分子质量大大小小直径大小直径大小大于凝胶颗粒孔道直径大于凝胶颗粒孔道直径小于凝胶颗粒孔道直径小于凝胶颗粒孔道直径运动路径运动路径被阻挡在凝胶颗粒外面而迅被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过速通过因扩散进入凝胶颗粒内部而因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留被滞留运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路程运动路程较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先先后后缓冲溶液缓冲溶液1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化发生明显变化的溶液。的溶液。2、作用：、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持的影响，维持pH基本不变。基本不变。3、配制：、配制：通常由通常由12种缓冲剂溶解于水中配制种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。还记得人体血液中的缓冲液吗？还记得人体血液中的缓冲液吗？H2CO3/NaHCO3 NaH2PO4/Na2HPO4你认为在血红蛋白整个实验中用的你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？缓冲液是什么？目的是什么？本实验使用的是本实验使用的是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用，目的是利用缓冲液模拟细胞内的缓冲液模拟细胞内的pHpH环境，保证血红蛋环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（白的正常结构和功能，便于观察（红色红色）和科学研究（和科学研究（活性活性）。）。电泳电泳1、概念：、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。过程。2、原理：、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3、类型：、类型：琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS：消除净电荷对迁移率的影响。：消除净电荷对迁移率的影响。电泳电泳实验操作步骤实验操作步骤样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 水分水分 血浆血浆 固体物质固体物质血液血液 白细胞白细胞 血细胞血细胞 血小板血小板 红细胞红细胞血红蛋白（血红蛋白（90）血红蛋白的组成血红蛋白的组成 血红素基团血红素基团可携带一分子可携带一分子O2或一分子或一分子CO21、红细胞的洗涤红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放、血红蛋白的释放3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液4、透析、透析（一）样品处理（一）样品处理问题：问题：1、刚采集的血样要做、刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？怎样的处理？为什么？加入抗凝血剂，加入抗凝血剂，防止血液凝固。防止血液凝固。2、怎样洗涤？、怎样洗涤？采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次低速短时间离心低速短时间离心 生理盐水生理盐水1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤3、洗涤的目的是什么？、洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。4、洗涤干净的标志是什么？、洗涤干净的标志是什么？直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。净。1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤2.释放血红蛋白释放血红蛋白阅读思考：阅读思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：1.蒸馏水蒸馏水的作用是的作用是_。2.加入加入甲苯甲苯的作用是的作用是_。3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心离心管管烧杯烧杯有机溶剂有机溶剂血红蛋白血红蛋白分分 液液 漏漏 斗斗有机溶剂有机溶剂（无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液（红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）暗红色沉淀物）3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液高速离心滤纸过滤漏斗分液高速离心滤纸过滤漏斗分液20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析血红蛋白透析的目的是什么？透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋去除血红蛋白中的小分白中的小分子杂质子杂质透析的原理及目的？（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作打孔挖穴安管覆网纱包插管2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡3、样品的加入和洗脱、样品的加入和洗脱调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床洗脱收集分装蛋白质2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡磷酸缓冲液磷酸缓冲液 沸水浴加热沸水浴加热 紧密紧密(pH为为7.0)不得有气泡不得有气泡（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作3、样品的加入和洗脱、样品的加入和洗脱调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床洗脱收集分装蛋白质磷酸缓冲液磷酸缓冲液 (1)不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面(pH为为7.0)(2)贴壁加样贴壁加样 (3)使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作蛋白质的提取和分离步骤蛋白质的提取和分离步骤1、样品处理、样品处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液。血红蛋白溶液。2、粗分离、粗分离经过透析去除分子量较小的杂质。经过透析去除分子量较小的杂质。3、纯化、纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白质除去。通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白质除去。4、纯度鉴定、纯度鉴定通过通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。收集得到的纯化后的血红蛋白收集得到的纯化后的血红蛋白问题：问题：1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？液处理的目的是什么？让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。练习巩固：练习巩固：1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（应用越来越深入，首先要做的一步是（）A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2、使用使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（的电泳迁移率完全取决于（）A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异DB3、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（的叙述，正确的是（）A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是（、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是（）A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固AD5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子