小鼠实验胚胎技术课件

小鼠实验胚胎技术与应用小鼠实验胚胎技术与应用 眼科学实验动物中心 黄冰1 1完整版课件完整版课件提纲提纲一、小鼠实验胚胎技术一、小鼠实验胚胎技术 1 1 1 1、母鼠超数排卵、母鼠超数排卵、母鼠超数排卵、母鼠超数排卵 2 2 2 2、胚胎收集、胚胎收集、胚胎收集、胚胎收集 3 3 3 3、胚胎体外培养、胚胎体外培养、胚胎体外培养、胚胎体外培养 4 4 4 4、假母制备、假母制备、假母制备、假母制备 5 5 5 5、胚胎体内移植、胚胎体内移植、胚胎体内移植、胚胎体内移植 二、应用二、应用:转基因动物模型的制作转基因动物模型的制作 1 1 1 1、定义、定义、定义、定义 2 2 2 2、制作方法和原理制作方法和原理制作方法和原理制作方法和原理 2 2完整版课件完整版课件小鼠实验胚胎技术小鼠实验胚胎技术3 3完整版课件完整版课件超数排卵：超数排卵：给予发情间期的母鼠一定量的给予发情间期的母鼠一定量的促进卵泡成熟和卵子排放的激素，母鼠可促进卵泡成熟和卵子排放的激素，母鼠可以同时段排放比正常排卵数多一倍以上的以同时段排放比正常排卵数多一倍以上的成熟卵子。成熟卵子。PMSGPMSG（孕马血清促性腺激素）（孕马血清促性腺激素）（孕马血清促性腺激素）（孕马血清促性腺激素）：促进卵泡促进卵泡促进卵泡促进卵泡成熟。成熟。成熟。成熟。HCGHCG（人绒毛膜促性腺激素）（人绒毛膜促性腺激素）（人绒毛膜促性腺激素）（人绒毛膜促性腺激素）：促进卵泡成促进卵泡成促进卵泡成促进卵泡成熟和卵子排放。熟和卵子排放。熟和卵子排放。熟和卵子排放。4 4完整版课件完整版课件假母：假母：性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，子宫内膜会处于增殖和接受胚胎着床的生子宫内膜会处于增殖和接受胚胎着床的生理状态。一旦有胚胎进入子宫腔内，胚胎理状态。一旦有胚胎进入子宫腔内，胚胎便可以在其子宫内着床发育成个体。便可以在其子宫内着床发育成个体。鼠类动物、兔子有此特性，其他动物鼠类动物、兔子有此特性，其他动物需借助激素。需借助激素。5 5完整版课件完整版课件6 6完整版课件完整版课件小鼠实验胚胎技术的应用小鼠实验胚胎技术的应用 -转基因动物模型的制作转基因动物模型的制作7 7完整版课件完整版课件转基因动物转基因动物:转基因动物转基因动物(transgenic animal)是指以实验手段导入的外源基因在其是指以实验手段导入的外源基因在其基因组内基因组内稳定整合并能遗传给后代稳定整合并能遗传给后代的的一类动物。一类动物。8 8完整版课件完整版课件转基因动物模型转基因动物模型:转基因动物模型转基因动物模型(transgenic animal model)是指利用转基因动物是指利用转基因动物制作手段导入的制作手段导入的人类疾病基因人类疾病基因在其基在其基因组因组稳定整合、遗传并表达产生类似稳定整合、遗传并表达产生类似于人类疾病于人类疾病的一类动物。的一类动物。9 9完整版课件完整版课件1010完整版课件完整版课件1111完整版课件完整版课件1212完整版课件完整版课件1313完整版课件完整版课件1414完整版课件完整版课件1515完整版课件完整版课件1616完整版课件完整版课件1717完整版课件完整版课件 LIM1基因敲除无脑小鼠1818完整版课件完整版课件 震颤小鼠与多发性硬化1919完整版课件完整版课件震颤小鼠与多发性硬化2020完整版课件完整版课件构建的载体通过同源重组方式构建的载体通过同源重组方式整合入动物个体基因组的特定位点整合入动物个体基因组的特定位点克隆目的基因克隆目的基因精子精子载体法载体法构建载体构建载体雄原核雄原核注射法注射法 胚胎胚胎 感染法感染法曲细精管曲细精管注射法注射法胚胎胚胎干细胞法干细胞法核移植核移植法法目的基因随机整合入动物个体基因组目的基因随机整合入动物个体基因组目的基因转录、翻译目的基因转录、翻译产生蛋白和表现功能产生蛋白和表现功能转基因动物转基因动物靶基因不能转录、翻译，不能产靶基因不能转录、翻译，不能产生蛋白和表现功能生蛋白和表现功能靶基因被删除或灭活靶基因被删除或灭活基因敲除动物基因敲除动物2121完整版课件完整版课件精体载体法：精体载体法：将外源基因附着在精子上，通过体外受精或单精子注射法将外源基因导入受精卵；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。2222完整版课件完整版课件精体载体法流程图精体载体法流程图 目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化 与精子共孵育与精子共孵育与精子共孵育与精子共孵育 卵子卵子卵子卵子 体外受精或单精子注射体外受精或单精子注射体外受精或单精子注射体外受精或单精子注射 受精卵受精卵受精卵受精卵DNADNA复制，外源基因整合复制，外源基因整合复制，外源基因整合复制，外源基因整合 双细胞期胚胎假母体内移植双细胞期胚胎假母体内移植双细胞期胚胎假母体内移植双细胞期胚胎假母体内移植 产生个体产生个体产生个体产生个体 外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群2323完整版课件完整版课件 精子载体法精子载体法2424完整版课件完整版课件精体载体法特点：精体载体法特点：优点：简单 不需要构建特殊的载体不需要构建特殊的载体 单纯的外源基因单纯的外源基因DNADNA片段片段 缺点：成功率低 2525完整版课件完整版课件雄原核注射法：雄原核注射法：通过显微注射的方法将外源基因注射入受精卵的雄原核区；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。2626完整版课件完整版课件雄原核注射法流程图雄原核注射法流程图 目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化 显微注射至受精卵雄原核显微注射至受精卵雄原核显微注射至受精卵雄原核显微注射至受精卵雄原核 受精卵受精卵受精卵受精卵DNADNA复制，外源基因整合复制，外源基因整合复制，外源基因整合复制，外源基因整合 双细胞期胚胎假母体内移植双细胞期胚胎假母体内移植双细胞期胚胎假母体内移植双细胞期胚胎假母体内移植 产生个体产生个体产生个体产生个体 外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群2727完整版课件完整版课件2828完整版课件完整版课件2929完整版课件完整版课件雄原核注射法特点：雄原核注射法特点：优点：相对简单、成功率高 不需要构建特殊的载体不需要构建特殊的载体 单纯的外源基因单纯的外源基因DNADNA片段片段 成功率可达成功率可达5%5%25%25%缺点：需要昂贵的仪器设备 显微注射仪、拉针仪、煅针仪显微注射仪、拉针仪、煅针仪3030完整版课件完整版课件胚胎感染法：胚胎感染法：将外源基因连接上逆转录病毒载体，再让逆转录病毒载体感染着床前后的胚胎，外源基因随机整合入受体基因组。3131完整版课件完整版课件胚胎感染法流程图胚胎感染法流程图 目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建 体外感染着床前胚胎体外感染着床前胚胎体外感染着床前胚胎体外感染着床前胚胎 体内感染着床前、后胚胎体内感染着床前、后胚胎体内感染着床前、后胚胎体内感染着床前、后胚胎 （共孵育或显微注射）（共孵育或显微注射）（共孵育或显微注射）（共孵育或显微注射）（输卵管或子宫内注射）（输卵管或子宫内注射）（输卵管或子宫内注射）（输卵管或子宫内注射）胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植 产生个体产生个体产生个体产生个体 筛选阳性嵌合体筛选阳性嵌合体筛选阳性嵌合体筛选阳性嵌合体 嵌合体之间交配嵌合体之间交配嵌合体之间交配嵌合体之间交配 外源基因阳性纯合个体产生、筛选外源基因阳性纯合个体产生、筛选外源基因阳性纯合个体产生、筛选外源基因阳性纯合个体产生、筛选 外源基因阳性个体的培育和建群外源基因阳性个体的培育和建群外源基因阳性个体的培育和建群外源基因阳性个体的培育和建群3232完整版课件完整版课件3333完整版课件完整版课件胚胎感染法特点：胚胎感染法特点：优点：感染率高 缺点：相对复杂 存在生物安全性问题 形成嵌合体 后期工作量大 3434完整版课件完整版课件曲细精管注射法：曲细精管注射法：将外源基因注射入雄性动物的曲细精管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随机整合入受体基因组，再通过精卵受精产生带有外源基因的个体。3535完整版课件完整版课件曲细精管注射法流程图曲细精管注射法流程图 目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化 逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建 雄性个体曲细精管注射雄性个体曲细精管注射雄性个体曲细精管注射雄性个体曲细精管注射 外源基因随机整合入雄性生殖细胞外源基因随机整合入雄性生殖细胞外源基因随机整合入雄性生殖细胞外源基因随机整合入雄性生殖细胞 雌、雄动物自然交配雌、雄动物自然交配雌、雄动物自然交配雌、雄动物自然交配 产生个体产生个体产生个体产生个体 外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群3636完整版课件完整版课件3737完整版课件完整版课件曲细精管注射法特点：曲细精管注射法特点：优点：相对简单 不需要昂贵仪器缺点：成功率较低 3838完整版课件完整版课件胚胎干细胞法：胚胎干细胞法：将外源基因转染胚胎干细胞，再通过嵌合体技术或核移植技术产生带有外源基因的胚胎干细胞来源的转基因个体。3939完整版课件完整版课件胚胎干细胞法流程图胚胎干细胞法流程图 目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化目的基因克隆、纯化 转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选 受体囊胚腔注射受体囊胚腔注射受体囊胚腔注射受体囊胚腔注射 核移植至受体卵母细胞核移植至受体卵母细胞核移植至受体卵母细胞核移植至受体卵母细胞 胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植 胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植 产生嵌合体产生嵌合体产生嵌合体产生嵌合体 产生阳性克隆个体产生阳性克隆个体产生阳性克隆个体产生阳性克隆个体 嵌合体之间交配嵌合体之间交配嵌合体之间交配嵌合体之间交配 外源基因纯合阳性个体筛选外源基因纯合阳性个体筛选外源基因纯合阳性个体筛选外源基因纯合阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群阳性个体的培育和建群4040完整版课件完整版课件4141完整版课件完整版课件嵌合体动物：嵌合体动物：组成一个动物个体的细胞来源于两组成一个动物个体的细胞来源于两 个或两个以上的动物品系或品种。个或两个以上的动物品系或品种。4242完整版课件完整版课件嵌合体动物嵌合体动物制作方法：制作方法：一、聚合法一、聚合法1.胚胎胚胎-胚胎：两个胚胎：两个8细胞期细胞期桑椹期的胚桑椹期的胚胎去透明带后，在植物血凝素的作用下，胎去透明带后，在植物血凝素的作用下，互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎，互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎，移植后发育成一个个体。移植后发育成一个个体。4343完整版课件完整版课件2.胚胎胚胎-胚胎干细胞：一个胚胎干细胞：一个8细胞期细胞期桑椹桑椹期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝素的作用下，形成一个融合胚胎，移植素的作用下，形成一个融合胚胎，移植后发育成一个个体。后发育成一个个体。聚合法的特点：聚合法的特点：不需要昂贵仪器，但成不需要昂贵仪器，但成功率低。功率低。4444完整版课件完整版课件二、显微注射法二、显微注射法1.1.成体细胞：将成体细胞显微注射入囊胚期胚胎成体细胞