基于循环肿瘤DNA定量KRAS基因突变在结直肠癌诊疗中的应用研究课件

基于循环肿瘤DNA定量KRAS基因突变在结直肠癌诊疗中的应用研究立项依据世界卫生组织日前发布，全球结直肠癌(colorectalcancer，CRC)患者数量正在以惊人的速度不断增加。我国是结直肠癌的高发国家。立项依据图120032014年中国结直肠癌发病率的变化*ASR(1/105）我国每年约有120万新发病例，导致约60万患者死亡。现结直肠癌占国内恶性肿瘤发病率第三位和死亡率第五位。立项依据*李道娟,李倩,贺宇彤.结直肠癌流行病学趋势J.肿瘤防治研究,2015,卷缺失(3):305-310.万德森.结直肠癌流行病学与预防J.中国中西医结合外科杂志,2011,(1):3-7CRC靶向药物:表皮生长因子受体（Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）抑制剂西妥昔单抗立项依据西妥昔单抗对野生型KRAS基因的患者有效西妥昔单抗对突变型KRAS基因的患者无效1.样本来源：采用源发病灶组织，操作繁琐，取材创伤大；2.患者肿瘤组织不同部位分子遗传信息存在差异；3.患者的疾病不同阶段分子遗传信息存在差异；4.肿瘤基因稀有突变检测率低；肿瘤基因突变检测现存在的难点设计思路设计思路肿瘤DNA肿瘤DNA（CirculatingTumorDNA,ctDNA）是肿瘤细胞主动分泌或者肿瘤组织破碎、凋亡后进入血液循环系统中，大小通常为160-180bp的DNA片段。数字微滴PCR：超灵敏的精确定量方法数字微滴PCRddPCR是一种基于单分子模板PCR扩增，进行核算拷贝数精确定量的分析方法。DNA模版ddPCR扩增反应结果读取目标片段定量技术检出限优点一代测序10%可测全基因序列，价格便宜实时荧光定量PCR1%可测已知位点，价格便宜，条件成熟等位基因特异性扩增法0.1%可测已知位点，方便全基因组测序0.1-1%可测全基因序列，价格较便宜数字微滴PCR0.01%或更低高灵敏度、高特异性，现有检测技术比较 表1 现有基因突变检测技术方法比较本项目提出建立基于ddPCR技术的KRAS基因突变定量检测方法，并将其应用于ctDNA中KRAS基因突变检测及其拷贝数的绝对定量分析，为CRC患者的早期筛查、预后判断、指导临床用药及肿瘤的转移与复发监测提供准确、便捷的实验室依据。设计思路图2ddPCR检测KRAS基因热点突变原理图设计思路技术路线与方案技术路线临床病例收集KRAS基因EXON2测序引物设计CRC患者血液和肿瘤组织中KRAS基因PCR扩增测序构建（热点突变）野生型和突变型质检针对热点突变设计ddPCR引物探针KRAS基因ddPCR定量检测方法的建立及方法的评价CRC患者ctDNA中KRAS基因突变ddPCR定量检测比较术前ctDNA与组织中KRAS基因突变检测结果比较术前与术后24HctDNA中KRAS基因突变的定量结果动态检测随访CRC患者ctDNA上KRAS基因突变，并与同期CEA结果比较临床用药指导，预后判断序效评估肿瘤转移与复发监测临床应用研究预实验结果病理因素 病例数 所占百分比（%）性别 男性 3759.6%女性2540.4%年龄（岁）604471.0%601829.0%肿瘤部位结肠2133.9%直肠4166.1%组织学病理类型高分化腺癌23.2%中分化腺癌4267.7%低分化腺癌1321.0%高分化鳞癌11.6%神经内分泌癌46.5%肿瘤浸润程度局限于肠壁2946.8%穿透肠壁3353.2%样本临床资料 表2 62例样本临床资料统计样本临床资料图362例样本临床资料男女比例分布饼图图462例样本临床资料年龄分布饼图图562例样本临床资料肿瘤部位分布饼图图662例样本临床资料组织学病理类型分布饼图图7肿瘤组织基因组DNA电泳结果；1-7:患者肿瘤组织样本;M泳道：HINDIII；预实验结果1KRAS基因第2外显子PCR扩增引物:上游引物序列为：5-AGGTACTGGTGGAGTATTTGATAG-3下游引物序列为：5-TGGTCAGAGAAACCTTTATCTG-3预实验结果2图8肿瘤组织DNA中KRAS基因PCR扩增产物电泳图；1-3:患者肿瘤组织样本，M:DL4500；项目可行性实验对象：温州医科大学附属第二医院肛肠科收集收集的结肠癌病例样本收集:1、肿瘤原灶组织2、血浆ctDNA前期工作基础队员参与曾完成ABCG2基因rs2231142位点多态性与浙南地区人群原发性痛风的相关性研究的课题项目可行性图9微滴数量分布图图11第一代测序法检测ABCG2基因rs2231142位点基因分型反向测序结果：（A）图为AA型；（B）图为CC型；（C）图为AC型项目可行性图10ddPCR测序法检测ABCG2基因rs2231142位点基因分型结果：（A）图为AA型；（B）图为CC型；（C）图为AC型实验平台：温州医科大学，浙江省省属高等院校，浙江省重点建设大学，实验室拥有专业实验室面积合计2000多平方米。因此实验室为本课题的进行提供了必备的硬件条件，能够保证本课题的顺利进行。项目组成员获奖情况分别参加2014,2015年浙江省生命学科竞赛均获二等奖；论文发表温州地区消费者对转基因食品的认知调查与分析；腺苷A2AS受体基因对脓毒症肝损伤小鼠肝脏超微结构改变的影响；课题项目负责或参与温州医科大学生本专科科研项目；浙江省新苗计划工作条件项目创新点无创性实时性高特异性高敏感性项目创新点实施评估患者的病情进展，克服肿瘤组织异质性液体活检，取材便捷精准监控患者用药反应快速简便检测基因突变请 批 评 指 正