大学课程2细胞培养的条件与培养液ppt课件

第二章第二章.细胞培养的条件与培养液细胞培养的条件与培养液第一节第一节.细胞培养的条件细胞培养的条件细胞培养的环境条件细胞培养的环境条件细胞的营养细胞的营养一、细胞培养的环境条件细胞培养的环境条件温度温度渗透压渗透压气体环境和气体环境和pH细胞接种密度细胞接种密度剪切力和气泡剪切力和气泡二维与三维二维与三维温度：温度：哺乳动物哺乳动物37左右，对低温的耐受力相对强于高温。左右，对低温的耐受力相对强于高温。低温还有助于大规模细胞培养时重组蛋白的表达。低温还有助于大规模细胞培养时重组蛋白的表达。渗透压：渗透压：动物细胞对培养液渗透压的变化敏感，理想的渗动物细胞对培养液渗透压的变化敏感，理想的渗透压因物种和细胞类型而异，一般培养液的渗透压为透压因物种和细胞类型而异，一般培养液的渗透压为260-320mmol/L，适合大多数细胞。渗透压控制不仅是为了维，适合大多数细胞。渗透压控制不仅是为了维持细胞张力，也为了调节细胞的代谢。持细胞张力，也为了调节细胞的代谢。气体环境和气体环境和pH：通常采用通常采用5%CO2的空气。其中氧气参的空气。其中氧气参与三羧酸循环，氧分压通常略低于大气压水平。与三羧酸循环，氧分压通常略低于大气压水平。CO2既既是代谢产物，也是必需成分，与培养液是代谢产物，也是必需成分，与培养液pH维持有关，维持有关，培养过程中因细胞数增多和细胞代谢活动加强，释放培养过程中因细胞数增多和细胞代谢活动加强，释放CO2导致培养液变酸，因此通常采用开放式培养并借助导致培养液变酸，因此通常采用开放式培养并借助缓冲系统维持培养液缓冲系统维持培养液pH 7.2-7.4。细胞接种密度：细胞接种密度：太高太低都不利于细胞生长增殖，具体太高太低都不利于细胞生长增殖，具体密度的确定应结合细胞类型和培养目的。密度的确定应结合细胞类型和培养目的。剪切力和气泡：剪切力和气泡：不同类型和状态的细胞对剪切力的敏感性不同类型和状态的细胞对剪切力的敏感性不同，大规模动物细胞悬浮培养时要设计合理的反应器，不同，大规模动物细胞悬浮培养时要设计合理的反应器，如选择混合性能好且剪切力小的搅拌桨叶，控制合适的搅如选择混合性能好且剪切力小的搅拌桨叶，控制合适的搅拌转速和气泡尺寸，或采用无泡供氧系统、通纯氧等，以拌转速和气泡尺寸，或采用无泡供氧系统、通纯氧等，以降低湍流涡旋和气泡破碎过程中对细胞的损伤。降低湍流涡旋和气泡破碎过程中对细胞的损伤。二维与三维：二维与三维：一般的二维培养与体内环境相差较大，表现一般的二维培养与体内环境相差较大，表现出培养细胞与体内细胞的差异，因此开发生物材料或非生出培养细胞与体内细胞的差异，因此开发生物材料或非生物材料作为支架的物材料作为支架的3D培养研究成为热点。培养研究成为热点。二、细胞的营养二、细胞的营养体外培养细胞与体内细胞在营养代谢上不同，后者受神体外培养细胞与体内细胞在营养代谢上不同，后者受神经和体液调节经和体液调节体内细胞存在更新与衰亡的平衡，而体外培养要求细胞体内细胞存在更新与衰亡的平衡，而体外培养要求细胞增殖速度快于分化和衰亡速度，因此营养要求必然不同增殖速度快于分化和衰亡速度，因此营养要求必然不同不同类型细胞的营养要求不同不同类型细胞的营养要求不同体外培养细胞除了糖类、氨基酸和脂类外，还需要一定体外培养细胞除了糖类、氨基酸和脂类外，还需要一定的无机盐、维生素和微量元素，并补充各种促生长因子的无机盐、维生素和微量元素，并补充各种促生长因子第二节第二节.细胞培养液及常用液体细胞培养液及常用液体培养基培养基/培养液培养液(culture medium)平衡盐溶液（平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）其它溶液其它溶液一、培养基一、培养基/培养液培养液指指维持体外培养细胞生存和生长的液相基质。是细胞培养中维持体外培养细胞生存和生长的液相基质。是细胞培养中最重要的影响因素。理想的培养液应具备以下条件：最重要的影响因素。理想的培养液应具备以下条件：保持正常细胞渗透压和保持正常细胞渗透压和pH缓冲系统缓冲系统须供给细胞基本营养物，包括细胞合成代谢、能量代谢等须供给细胞基本营养物，包括细胞合成代谢、能量代谢等没有毒物或抑制细胞生长的物质没有毒物或抑制细胞生长的物质各种基本成分的量合适，互相平衡，能精确定量调整各种基本成分的量合适，互相平衡，能精确定量调整容易制成成品，生产简单，最好能高压灭菌容易制成成品，生产简单，最好能高压灭菌天然培养基（天然培养基（natural medium）指来自动物体液或利用动物组织分离提取的一类培养基。指来自动物体液或利用动物组织分离提取的一类培养基。包括血清、血浆、鸡胚浸出液、淋巴液等。包括血清、血浆、鸡胚浸出液、淋巴液等。优点：营养成分丰富，与体内环境接近，培养细胞有效。优点：营养成分丰富，与体内环境接近，培养细胞有效。缺点：成分复杂，批间差异大，来源有限，很难标准化，缺点：成分复杂，批间差异大，来源有限，很难标准化，易发生支原体污染。易发生支原体污染。合成培养基（合成培养基（synthetic medium）根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的培养液。如成的培养液。如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。等。主要成分是必需氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和主要成分是必需氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它辅助物质。其它辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对明确，成本低。优点：标准化生产，组分和含量相对明确，成本低。缺点：缺少某些成分，仅能维持细胞不死，不能完全满足缺点：缺少某些成分，仅能维持细胞不死，不能完全满足体外细胞生长增殖需要，使用时需添加适量的血清，因此体外细胞生长增殖需要，使用时需添加适量的血清，因此也作为基础培养基。也作为基础培养基。各种培养基成分有较大差异，适用细胞种类不同各种培养基成分有较大差异，适用细胞种类不同l储存时间：储存时间：1-2 month at 2-10 ClpH：7.2-7.4l缓冲成分：缓冲成分：NaHCO3,HepeslGlucose：high or lowl抗生素添加与否抗生素添加与否l过滤除菌：过滤除菌：0.22ml水的质量控制（三蒸水或超纯水）水的质量控制（三蒸水或超纯水）l酚红等指示剂的选用酚红等指示剂的选用培养液配制培养液配制基础培养基基础培养基80-95血清血清5-20碳酸氢钠碳酸氢钠2.0 g/L青、链霉素各青、链霉素各100IUml完全培养液组成完全培养液组成血清（血清（serum）的应用）的应用含含有有许许多多营营养养物物质质如如：蛋蛋白白、激激素素、生生长长因因子子、细细胞因子、维生素等胞因子、维生素等是很好的缓冲系统是很好的缓冲系统含含转转铁铁蛋蛋白白、铜铜蓝蓝蛋蛋白白等等，具抗氧化活性具抗氧化活性含含有有贴贴壁壁因因子子或或粘粘附附蛋蛋白白可以帮助细胞贴壁可以帮助细胞贴壁对于重金属有解毒作用对于重金属有解毒作用含含蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂，保保护护细细胞免受蛋白酶损伤胞免受蛋白酶损伤成成分分复复杂杂，其其中中一一些些物物质质能能干干扰扰受受体体的的检检测测和和各各种种因因子作用机制的研究子作用机制的研究有有去去分分化化作作用用，能能促促使使成成纤维细胞过量生长纤维细胞过量生长批批次次间间差差异异大大，给给标标准准化化生产和连续使用带来限制生产和连续使用带来限制可可能能携携带带动动物物源源性性病病毒毒、支原体等造成污染支原体等造成污染蛋蛋白白含含量量高高，影影响响目目的的蛋蛋白分离纯化白分离纯化v血清种类血清种类胎牛血清（胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、新生牛血清）、新生牛血清（new born calf serum，NBS）、小牛血清（）、小牛血清（calf serum，CS）、兔血清、马血清等，以）、兔血清、马血清等，以FBS质量最好。质量最好。v血清的灭活血清的灭活目的：使血清中的补体成分失活目的：使血清中的补体成分失活方法：方法：56 C水浴，水浴，30minv血清的批间差异血清的批间差异来源：动物饲养方式、季节、血清处理步骤来源：动物饲养方式、季节、血清处理步骤质量稳定性控制：检测小样品质量，选择最佳者，大批质量稳定性控制：检测小样品质量，选择最佳者，大批购买，分装后购买，分装后-20 C或或-80 C储存储存无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了分离提可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了分离提纯目的产物的程序，节省成本，还可进行细胞的选择纯目的产物的程序，节省成本，还可进行细胞的选择性培养，避免血清的去分化作用。性培养，避免血清的去分化作用。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中成。无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。贴壁和扩展因子等。1975年，年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株。胞株。无血清培养液（无血清培养液（Serum-free medium）二、平衡盐溶液二、平衡盐溶液平衡盐溶液（平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）：主要由无机）：主要由无机盐和葡萄糖配制而成，具有维持渗透压、缓冲和调节盐和葡萄糖配制而成，具有维持渗透压、缓冲和调节pH及供给细胞生存所需的能量和无机离子等作用，可用于组及供给细胞生存所需的能量和无机离子等作用，可用于组织或细胞的洗涤和作为合成培养基的基础液。织或细胞的洗涤和作为合成培养基的基础液。常用：常用：PBS（phosphate buffer saline，磷酸缓冲液），磷酸缓冲液），Hanks液，液，Earle液等液等选择和配制选择和配制BSS的注意点：的注意点：洗涤细胞用的需要无钙镁条件，多用洗涤细胞用的需要无钙镁条件，多用PBS或或D-Hanks试剂分析纯以上（试剂分析纯以上（AR或或GR），三蒸水配制），三蒸水配制钙盐和镁盐单独溶解，避免沉淀钙盐和镁盐单独溶解，避免沉淀可先配制可先配制10倍母液，用前稀释倍母液，用前稀释常用的平衡盐溶液（常用的平衡盐溶液（g/L）三、其它溶液三、其它溶液pH调节液：调节液：常用常用NaHCO3和和Hepes液液消化液：消化液：用于组织细胞的分散和贴壁细胞的脱落分散用于组织细胞的分散和贴壁细胞的脱落分散胰蛋白酶：水解细胞间的蛋白质，浓度胰蛋白酶：水解细胞间的蛋白质，浓度0.25%或或0.5%EDTA溶液：化学螯合剂，离散贴壁细胞，浓度溶液：化学螯合剂，离散贴壁细胞，浓度0.02%胰酶胰酶EDTA混合液：混合液：1:1或或2:1混合也可用于新鲜组织的混合也可用于新鲜组织的消化或贴壁细胞的消化消化或贴壁细胞的消化抗生素溶液：抗生素溶液：加适量双抗（青、链霉素），以抑制可能加适量双抗（青、链霉素），以抑制可能存在的细菌的生长，浓度各存在的细菌的生长，浓度各100IU/ml。可先配。可先配100倍母液倍母液思考题思考题1.各种环境条件对细胞培养的主要影响各种环境条件对细胞培养的主要影响2.天然培养基有什么优缺点天然培养基有什么优缺点3.合成培养基的概念和优缺点合成培养基的概念和优缺点4.完全培养基的组成，为什么要添加血清完全培养基的组成，为什么要添加血清5.无血清培养液的研制有什么意义无血清培养液的研制有什么意义6.平衡盐溶液的概念和应用平衡盐溶液的概念和应用7.常用的消化液及其作用常用的消化液及其作用