DNA计算机原理、进展及难点

DNA计算机原理、进展及难点(V)：DNA分子的固定技术许进，李菲|),2)0(北京大学信息科学技术学院高可信软件技术教育部重点实验室，北京，100871)2)(空军装备研究院，北京，100085)摘 要 在 DNA计算机的研制中，DNA分子的固定是首先需要处理的一个最为基本的技术问题。事实上，DNA分子的固定技术不仅是生物计算的一个基本技术，而且是整个基因工程、生物芯片、甚至某些疾病诊疗的基础。基于此，本文将对DNA分子的固定技术给予较为系统地研讨，包括基本原理、具体方法等。文中引入了“D N A 分子固定系统”的结构体系，并对该结构体系中载体子系统、固定剂子系统、标记子系统这三个主要子系统进行了详细地论述。关键词 DNA计算机；DNA固定技术；固定系统；固定剂、载体、分子标记、磁珠分离技术；AcrditeM技术DNA Computer Principle,Advances and Difficulties(V):Immobilization Technology of DNA MoleculeXu Jin,Li Fei1)2)(Institute of Software,School of Electronics Engineering and Computer Science,Peking University,Key laboratory of High Confidence Software Technologies(PekingUniversity),Ministry of Education,Beijing,100871)2,(Equipment Academy of Air Force,Beijing 100085)Abstract:In the research of DNA computer,immobilization of DNA molecule is an essentialtechnology at first.Actually,immobilization of DNA molecule is not only a basic tool ofbiological computation,but also the foundation of the whole Genetic Engineering and bio-chip,even some disease treatment.In this paper,immobilization technology of DNA molecule,including its basic principle and factual methods is discussed in detail.The architecture ofbio-molecular immobilization system is presented,and we mainly introduce its threesubsystemssubstrate system,fixer system and molecular marker system.Key words:DNA computation;immobilization of DNA molecular;immobilization system;fixer;substrate;molecular marker;magnetic bead purification;Aery di te technology;1.引言从目前的研究现状来看，D N A计算研究中主要存在三个难点，第一个是解空间指数爆炸问题，即随着问题规模的增大所需要的D N A量呈指数增长；第二个难点是编码问题。对于规模较大的D N A计算而言，作为代表问题“数据”的D N A分子的编码涉及到诸如解链温度T“,的一致性、特异性杂交的准确性、与D N A计算中各种生化操作的适应性等各种不同约束条件的限制。因而，D N A序列的编码问题是一个很困难的数学问题。许多学者认为这个问题是NP-完全问题山叫 第三个难点是解的检测问题。检测问题几乎“充满”了 D N A计算的始终。其中如何给出快速准确的检测技术，以及如何利用现有的IT技术进行解的检测是D N A计算机研究中的重点图。从目前的研究现状来看，D N A传感器技术可能是D N A计算机检测中一个很有希望的工具。而D N A分子的固定技术则是D N A传感器中的一项关键技术。另外，D N A分子的固定技术在医疗、生物芯片以及基因工程等众多领域均为基础性的技术。作为D N A计算中的“数据”一D N A分子，若在计算过程中只在溶液中进行杂交反应，而不受其它载体的约束，则我们把这种D N A分子称为无载体的D N A分子。若D N A分子被固定在某物体上，则把该物体称为D N A分子的载体。在D N A计算中，通常这些载体有诸如磁珠、凝胶、金属、玻璃等。而如何将D N A分子固定在这些载体上，即D N A分子的固定问题，不仅是D N A计算中的一个基本问题，也是研制D N A计算机必须解决的问题。本文拟重点对D N A分子的固定技术展开研讨。实际上，D N A分子的固定技术不仅是研制D N A计算机的基本技术，而且是D N A计算模型研究中的常用技术。如1994年Adleman所建立的求解有向Hamilton路问题的DNA计算模型中就使用了将D N A分子固定在磁珠上的技术同，该研究组在2002年的D N A计算模型中使用了将D N A分子固定在聚丙烯酰胺凝胶上的固定技术。文献 8中所建立的枚举型图顶点着色D N A计算模型中也使用了磁珠固定D N A分子的技术等。文献 9所建立的D N A计算模型中，固定D N A分子在玻璃上。追其历史，生物分子固定技术的研究始于上世纪60年代，美国学者Clark首先采用了固定化酶方法制作酶电极“】，其后，关于这方面的研究发展迅速WM。目前D N A探针的固定方法主要有共价键合法、原位合成法、吸附法、自组装膜法、生物素-亲和素方法、AcryditeTM技术等。这里还要提及的是，我国在D N A固定技术及应用方面的研究也取得了可喜的成果，如姚守拙院士网，张先恩教授口等人的工作。另外，刘盛辉等时将石墨电极表面硅烷化导入氨基，然后用碳二亚胺（E D C）作偶联活化剂，在电极表面固定单链DNA。郑赛晶等的采用微孔穴充石蜡石墨电极固载ssDNA。黄海珍等 对D N A探针的固定方法作了详细评述。有关这方面一些详细的介绍参见文献 18。2.DNA分子的固定系统本节引入了“D N A分子固定系统”的结构体系，以便于更能系统地刻画D N A分子的固定技术。所谓“D N A分子固定系统”，是由载体子系统、对象子系统、固定剂子系统和标记子系统四个子系统构成。可将其定性地描述为：固定系统=（载体子系统，对象子系统，固定剂子系统，标记子系统）如图2.1所示：图 2.1 固定系统结构示意图根 据D N A计算模型的不同，可能用到的D N A载体也会不同。载体也称为支持物，是指作为固定相的材料“支常用的载体有诸如磁珠、凝胶、玻璃、量子点以及金箔等，如图2.2所示：图 2.2 载体子系统在D N A计算中，固定的对象主要是D N A分子。当然，在R N A计算中的固定对象主要是R N A分子，而在整个基因工程中的固定对象则是蛋白质、R N A与D N A为主体的生物大分子等，如图2.3所示：对象子系统DNA分子 RNA分子蛋白质图2.3 生物计算中的对象子系统所谓固定剂，是指将固定对象固定在特定载体上所需要的介质，多数采用的是偶联，如共价键的偶联，离子键、氢键、磁力等各种引力的吸附，另外还可采用生物素-亲和素技术、分子自组装膜等，如图2.4所示：图2.4 固定剂子系统固定D N A分子或者其它生物大分子的主要目的是用于检测。因此，被固定的D N A分子常常需要进行标记。标记D N A分子通常采用诸如荧光标记、放射性和非放射性核素标记等方法，如图2.5所示：标记子系统放 射 性 标 记 I 非放射性标记其它种类标记图2.5 标记子系统从下节开始，我们将围绕着固定系统中相应的子系统进行详细讨论。3.载体子系统及其在DNA计算中的应用本节将主要介绍D N A计算中常用的三种载体：基于试管型D N A计算中常用的磁珠;基于凝胶电泳技术的载体一Acrydite；关于表面计算中的玻璃或者金箔等作为载体的处理。3.1磁珠技术在 DNA计算中，经常需要将双链DNA序列中的一条固定起来，通过加热，让互补的另一条参与杂交反应。若在试管里进行杂交反应，则通常将一条DNA链固定在磁珠上。我们把将一条DNA链固定在磁珠上的技术称为磁珠固定分离技术，简称为磁珠技术.这里将主要介绍磁珠技术的机理，特别针对其在DNA计算中应用的原理给予详细介绍。一般磁珠固定分离技术的基本方法是:通过抗原对偶联在磁珠表面的抗体或亲和配体的特异性识别，在外加磁场的作用下，达到分离、检测、纯化样品的目的】。磁珠分离方法主要有两类：-一 类是所谓的免疫-磁珠分离(Immuno-magnetic beads,IM B),其方法是在磁珠表面包被特异性单克隆体，主要用于分离细菌和病毒“22】；另一类是所谓的探针-磁珠分离(Probes-magnetic beads,PM B),具体操作是在磁珠表面包被亲和素，通过亲和素与生物素之间的特异性反应，将探针标记在磁珠表面。这种方法主要应用于捕捉核酸和PCR扩增冲MS,以及用于捕捉扩增产物，进行特异性分析团等。采用磁珠作为DNA分子载体有三大优势I?”亲水性磁性粒子能够比较稳定地悬浮在水溶液中，并可在外加磁场作用下定位于某一部位，其表面可固定各种功能分子如醐、抗体、D N A,甚至细胞等，因此在分子生物学、免疫测定、细胞分离与分类、基础医学、临床诊断、临床治疗等方面具有良好的应用前景；作为DNA分子的固定化载体，磁珠有利于固定 化 DNA分子从反应体系中分离和回收，还可以利用外部磁场控制磁性材料固定DNA分子的运动和方向；磁珠作为DNA分子的固定载体还具有以下优点：固定的DNA分子可重复使用，降低成本；适合大规模连续化操作；将 DNA分子固定在磁性粒子表面后，DNA分子的化学活性不受到任何影响。由于在DNA计算中主要采用PMB(探针-磁珠分离)方法,故在本文中只详细介绍这种方法。下面，我们将从磁珠的结构、材料与原理以及操作使用方法等几个方面来给予介绍。(1).磁珠结构磁珠由载体微球和配基结合而成，一般直径为0.26/m 3.00/m。理想的磁珠为均匀的球形，具有超顺磁性及保护性壳，其结构如图3所示，其中磁性材料主要有：Y-Fe2O4、Me-Fe2O4(Me=Co,Mn,Ni)、Fe3O4 Ni、Co、Fe、Fe-Co 和 Ni-Fe 合金等，磁性物质高分子层功能配基图3.1磁珠的基本结构图示目前被研究最多且应用最广泛的是铁及其氧化物（Fe、Fe2（）4 和 Fe3（）4 等）（2 7|高分子材料主要有：聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、多糖（纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖等）和牛血清白蛋白等。磁珠表面常带有化学功能的基团，如-OH、-NH2,-COOH和-CON。2等，使得磁珠载体几乎可以偶联任何具有生物活性的蛋白网僮咒功能配基主要有：配基必须具有生物专一性的特点，而且载体微球与配基结合后不影响或改变配基原有的生物学特性，保证微球的特殊识别功能。还可以在功能配基上配有亲和素。在单链DNA分子5 -端加入与亲和素相配的生物素网】。（2）.磁珠固定分离技术在DNA计算中应用原理及具体使用方法磁珠技术是DNA计算中经常用到的一种分离技术，分离用的磁珠表面需要大量的羟基、竣基、皴基、氨基，通过洗液与DN A结合，在磁场的作用下从溶液中分离出D N A,再用一种洗液使DNA从磁珠表面分离出来，最后通过磁场把废的磁珠分离出来，得到纯的DNA溶液。通常用亲和素-生物素方法进行磁珠固定分离。图3.2 磁珠在D N A计算中的应用原理示意图磁珠