核酸浓度、纯度的检测——DNA的电泳检测

核核酸酸浓浓度度、纯纯度度的的检测检测DNA的的电电泳泳检测检测实实 验验 目目 的的原理：原理：掌握紫外分光光度法掌握紫外分光光度法检检测测DNA浓浓度度和和纯纯度的度的原原理理。掌握掌握琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳检检测测DNA的原理的原理技技术术技能技能掌握紫外分光光度法掌握紫外分光光度法检检测测DNA浓浓度度和和纯纯度的度的步步骤骤和和计计算算方方 法。法。掌握掌握琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳检检测测DNA的操作的操作1 1、DNADNA分子分子的的琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳检测检测实验实验原理原理在中性或偏碱在中性或偏碱性性pH值值下下带负电带负电荷荷的的DNA向阳极迁向阳极迁移移。DNA电电泳速率与泳速率与电电荷效荷效应应无关（随着碱基数的增加无关（随着碱基数的增加，DNA 分子量增加，分子量增加，电电荷数也增加，荷数也增加，这样这样荷荷质质比基本比基本维维持一个常持一个常 数）。数）。琼琼脂糖凝胶作脂糖凝胶作为为一种固体支持基一种固体支持基质质,主要利用主要利用DNA分子在分子在 电场电场中的泳中的泳动时动时的的分子分子筛筛效效应应来达到分离混合物的目的。来达到分离混合物的目的。在恒在恒电场电场的一定的一定电场电场强强度下度下，DNA分子的迁移速率取决于分子的迁移速率取决于 由由DNA分子的分子的大大小小与与构型构型。DNA分子迁移速率分子迁移速率与其相与其相对对分子量成反比。分子量成反比。700bp900bp电电泳方向泳方向相同分子量相同分子量但不但不同同构型构型的的DNA分子迁分子迁移移速速率不率不同同。）质质粒粒DNADNA的的分子构分子构型型 (a(a)松松弛弛线线性性的的DNDNA A（L L (b)(b)松松弛弛开开环环（OCOC）(c(c)超超螺螺旋旋（cccccDcDN NA A）三三种构种构型型的的质质粒粒的的电电泳泳模模式式图图谱谱影响影响电电泳速率的因素泳速率的因素1.1.DNADNA分子量的大小分子量的大小2.2.琼琼脂糖凝胶的脂糖凝胶的浓浓度度3.3.DNADNA的分子构象的分子构象4.4.电压电压5.5.电电泳泳缓缓冲液的离子冲液的离子强强度度琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%溴酚兰的迁移率：与之相当的DNA大小1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度1%1.4%二甲苯青迁移率：与 之相当的DNA大小2Kb1.6Kb1 1、琼琼脂糖脂糖2 2、TBETBE缓缓冲冲液液:临临用用时时用水稀用水稀至至0.5TBE(0.5TBE(pH8.0pH8.08.2)8.2)3 3、核酸、核酸电电泳的指示泳的指示剂剂溴酚溴酚兰兰：在碱性液体中呈紫：在碱性液体中呈紫蓝蓝色色二甲苯青：在碱性液体中呈二甲苯青：在碱性液体中呈蓝蓝色色在在电电泳中，溴酚泳中，溴酚兰兰和二甲苯青的迁移率与下列双和二甲苯青的迁移率与下列双链线链线性性DNA片段相当：片段相当：试试剂剂4 4、载样缓载样缓冲冲液液(Loading(Loading Buffer)Buffer)注：指示注：指示剂剂一般与蔗糖、甘一般与蔗糖、甘油油或聚或聚蔗蔗糖糖400组组成成载载样缓样缓冲冲液液，其作用是：其作用是：增加增加样样品密度，使其比重增品密度，使其比重增加加，以，以确确保保DNA均均匀沉匀沉入加入加样样孔内孔内在在电电泳中形成肉眼可泳中形成肉眼可见见的指的指示示带带,可可预测预测核核酸酸电电泳泳的的速速度度 和位置和位置使使样样品呈色，使加品呈色，使加样样操作更操作更方便方便5 5、荧荧光染料光染料(GoldView(GoldView，GV)GV)GoldViewGoldView (GV)(GV)是一种可代替溴化乙是一种可代替溴化乙锭锭（EBEB）的新的新型核型核 酸染料，其灵敏度酸染料，其灵敏度与与EBEB相当相当，使用使用方方法与之法与之完完全相全相同同，在在 100ml100ml琼琼脂脂糖胶糖胶溶溶液中加液中加入入5l5l GoldViewGoldView即即可。在可。在紫紫外透外透射光射光 下下双双链链DNADNA呈呈现现绿绿色色荧荧光光，而而单单链链DNADNA呈呈现现红红色色荧荧光光。GoldView GoldView 不不仅仅能能染染DNADNA，也也可用于可用于染染RNARNA。PCR扩扩增增产产物的物的检测检测1.琼琼脂糖凝胶的制脂糖凝胶的制备备 根据根据样样品品DNA片段大小确定片段大小确定琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶浓浓度度；胶胶板板的的制制备备：胶胶槽槽置置于于水水平平支支持持物物上上（两两侧侧封封口口）,插插上上样样品品梳梳子子,注注意意观观察察梳梳子子齿齿下下缘缘应应与与胶胶槽槽底底面面保保 持持1mm左右的左右的间间隙；隙；胶液的制胶液的制备备：称：称取取0.2g琼琼脂脂糖糖,置于置于100ml锥锥形瓶形瓶中中,加入加入 20ml 0.5TBE稀稀释缓释缓冲液冲液,用保用保鲜鲜膜封口（避免水蒸气膜封口（避免水蒸气 过过度散失），然后在上面用度散失），然后在上面用枪头枪头扎个小孔（加扎个小孔（加热过热过程中程中 可以放出少量水汽，以免瓶内可以放出少量水汽，以免瓶内压压力力过过大），大），放入微波炉放入微波炉 里加里加热热至至琼琼脂糖全部熔化脂糖全部熔化（1-2min,液体液体变变透明透明）,取出取出 摇摇匀（匀（烫烫手！手！）,此此为为1%琼琼脂糖凝胶液。待胶冷却脂糖凝胶液。待胶冷却到到60 度左右，加入度左右，加入DNA染料染料Goldview 2 ul，混匀；，混匀；倒胶：将胶液倒胶：将胶液缓缓慢倒入胶板内，注意：倒胶慢倒入胶板内，注意：倒胶时时的温度不的温度不 可太低可太低,否否则则凝固不均匀；速度也不可太凝固不均匀；速度也不可太快快,否否则则容易出容易出现现 气泡。气泡。待胶完全凝固后（待胶完全凝固后（10min）,拨拨出梳子出梳子,注意不要注意不要损伤损伤凝凝胶胶,然后向槽内加然后向槽内加入入0.5TBE稀稀释缓释缓冲液至液面恰好没冲液至液面恰好没过过凝凝 胶的上表面。胶的上表面。2.加加样样：将下列：将下列样样品在品在洁净洁净的保的保鲜鲜膜或一次性手套表面混匀，膜或一次性手套表面混匀，用微量移液用微量移液枪枪小心加入凝胶的小心加入凝胶的样样品孔中。品孔中。8l PCR产产物物 +2l6载样载样液液8l 质质粒提取粒提取物物 +2l6载样载样液液8l pUC19 质质粒粒 +2l6载样载样液液(阳性阳性对对照照)5 l DL2000 Ladder Marker(DNA marker)5 l EcoR T14 Marker(阳性阳性对对照照)注：注意点注：注意点样样品要放阴极端！品要放阴极端！每加完一个每加完一个样样品要更品要更换换tip头头,以以防止防止互互相相污污染染；注意上注意上样时样时要小心操要小心操作作,避免避免损损坏坏凝凝胶或胶或将将样样品槽品槽底底部凝部凝胶胶刺穿刺穿。加加样样顺顺序序3.3.电电泳：加完泳：加完样样后后,合上合上电电泳槽盖泳槽盖,立即接通立即接通电电源。控制源。控制电压电压 最高不超最高不超过过5V/cm（按两极按两极间间距离距离计计算出算出总电压总电压）。当。当 溴酚溴酚蓝蓝条条带带移移动动到距凝胶前沿到距凝胶前沿约约2cm时时,停止停止电电泳。泳。(125V,30min)4.4.观观察和拍照察和拍照(1)(1)在在透透射射仪仪的的样样品品台台上上铺铺一一张张保保鲜鲜膜膜（全全班班共共用用一一张张保保 鲜鲜膜膜），赶赶去去气气泡泡，然然后后将将胶胶槽槽内内的的胶胶块块小小心心滑滑出出至至 样样品台上面。品台上面。(2)(2)在在300nm波波长长紫外透射紫外透射仪仪下下观观察察电电泳胶板泳胶板。DNA存存 在在处显处显示出肉眼可辨的示出肉眼可辨的绿绿色条色条带带。紫光灯下。紫光灯下观观察察时应时应 戴上防戴上防护护眼眼镜镜或有机玻璃面或有机玻璃面罩罩,以免以免损伤损伤眼睛眼睛。可拍可拍 照照记录实验结记录实验结果。果。本本实实验验的的预预期期结结果果PCR产产物物电电泳照片泳照片图图1:DNA Marker DL2,0002、3:PCR扩扩增增产产物物（500bp片段）片段）DL2000 DNA分子量分子量标标准准bpDNA分子分子量量标标准准500bpDL2000PCR产产物物质质粒在正常情况下粒在正常情况下以以cccDNA构构型型存在存在，在提取在提取过过程中程中由由于于机机 械力、酸碱度、械力、酸碱度、试剂试剂等的原等的原因因，可，可能能会会使使DNA链发链发生生断裂。断裂。所所以以，多数多数质质粒粗提物中含有三种粒粗提物中含有三种构构型的型的质质粒：粒：共共价价闭闭合合环环状状 DNA(cccDNA)；开开环环DNA(ocDNA）；）；线线形形DNA(lDNA)质质粒粒DNA琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳模泳模式式图图2、紫外分光、紫外分光光光度度法法检检测测核酸核酸的的浓浓度度、纯纯度度基本基本原理原理DNDNA A链链上碱基的上碱基的嘌嘌呤呤环环和和嘧啶环结嘧啶环结构具有吸收紫构具有吸收紫 外光的性外光的性质质，其最大吸收峰，其最大吸收峰在在260nm260nm处处。单链单链核酸核酸（RNARNA）由于其碱基暴露，所以其吸光度由于其碱基暴露，所以其吸光度较较双双链链高。高。浓浓度度测测定：定：在一定在一定范范围围内内，DNADNA或或RNARNA的光密的光密度度ODOD260260与其含与其含量量成正比成正比。当使用当使用1cm1cm比色杯比色杯，ODOD2602601 1时时，dsDNAdsDNA浓浓度度约为约为50g50g /ml/ml，RNARNA浓浓 度度约为约为40g/ml40g/ml；寡核苷酸寡核苷酸浓浓度度约约为为30g/ml30g/ml。根据以下公式可。根据以下公式可 以以计计算算DNADNA在溶液中的在溶液中的浓浓度：度：质质粒粒DNADNA浓浓度度(g(g/l l)=)=稀稀释释倍数倍数ODOD26026050/(100050/(1000 L L）其中其中：L L为为比色杯的光程（杯比色杯的光程（杯的的厚度厚度）；）；“50”“50”为为DNADNA在在ODOD260260=1=1时时的的 浓浓度。度。质质粒粒DNADNA浓浓度度(ng(ng/ll )=)=稀稀释释倍数倍数ODOD2602605050注注：ODOD260260值应值应在在0 01 1之之间间，以在，以在0.50.5左右左右为为好。好。这这样读样读数数比比较较准确准确。纯纯度度测测定：当定：当DNADNA样样品中含有蛋白品中含有蛋白质质、酚酚或其或其他他小分小分子子污污染染物物时时，会会 影影响响DNADNA吸吸光光度的准度的准确确测测定。一定。一般情般情况下同况下同时检时检测测同一同一样样品品的的ODOD260260、ODOD280280（280nm280nm是蛋白是蛋白质质的吸收峰）的吸收峰）和和ODOD230230（230nm230nm是酚是酚类类等等杂质杂质的吸的吸 收峰），收峰），计计算其比算其比值值来衡量来衡量样样品品的的纯纯度度。经验值经验值：纯纯DNADNA：OD260/OD2801.8OD260/OD2801.8(1.9,1.9,表明有表明有RNARNA污污染染或或DNADNA降解降解；1.61.6，表明有蛋白表明有蛋白质质或酚或酚污污染）染）纯纯RNARNA：OD260/OD2802.0OD260/OD2802.0 (1.8(1.8 2.2)2.2)实实 验验 步步 骤骤1.1.取取1010 l l自提的自提的质质粒粒DNADNA溶液用溶液用ddHddH2 2O O稀稀释释1010倍（倍（终终体体积积：100 100 l l）。）。2.2.以蒸以蒸馏馏水作参比，水作参比，对仪对仪器器进进行行调调零等零等调调整后，整后，测测定定质质粒粒样样 品的品的ODOD260260和和ODOD280280。3.3.计计算算ODOD260260/OD/OD280280之之比比,判断其判断其纯纯度。度。4.4.计计算算质质粒粒样样品的品的浓浓度：度：DN