N-乙酰-D-葡萄糖胺的性质-制备方法及应用

N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺葡萄糖胺的的性质、制备方法及应用性质、制备方法及应用 卢利平（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122）摘要摘要：N-乙酰-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，本文主要介绍了 N-乙酰-D-葡萄糖胺的结构与物理性质、制备方法及其在各个邻域中的应用。关键词关键词：N-乙酰-D-葡萄糖胺；结构与物理性质；制备方法；应用 1 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺葡萄糖胺概述概述 1.1 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺的研究历史葡萄糖胺的研究历史 早在 20 世纪 30 年代初，就有文献报道了关于N-乙酰-D-葡萄糖胺的制备方法。近些年来，随着人们对 GlcNAc 在生物体中生理特性的不断学习认识，一些发达国家如美国、日本等国家都在开发研究GlcNAc。近年来GlcNAc开始广泛应用于保健食品、美容化妆品，欧美已将 GlcNAc 用于预防和治疗风湿性关节炎的药物1。我国对 N-乙酰-D-葡萄糖胺的研究也越来越深入，李继衍等已发表了 2 篇关于其制备方法的报道2-3。随着我国甲壳素工业的快速发展，一些工厂也开始研制生产 N-乙酰-D-葡萄糖胺，并作为甲壳素的深加工产品1。中国人民解放军第三军医大学生物波研究中心徐启旺研究认为 GlcNAc 能调整肠道厌氧菌与需氧菌的比例，改善肠道微生态环境，促进双歧杆菌生长，对肠道疾病有治疗和预防效果，研究开发的用于治疗腹泻型肠易激综合征的药物表明其安全性和疗效都较高4。2008 年，侯卫南等用 HPLC 法对 N-乙酰-D-葡萄糖胺茶香异构体和相关物质进行研究，指出其溶于水后自型茶香异构体向 型转化并最终达到平衡，初步研究表明其固态为 构型，在水溶液中、相互转化并达到动态平衡，定性确定有关物质归属，为其定量检测提供可靠依据5。马晨丰等研究发现，蛋白质 O-GlcNAc 糖基化修饰参与糖尿病、阿尔茨海默病与心脏病等多种疾病病理生理过程，因此对其研究具有积极意义6。1.2 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺葡萄糖胺结构与结构与物理物理性质性质 1.2.1 GlcNAc 结构与物理性质结构与物理性质 GlcNAc 是生物细胞内糖蛋白等重要生物多糖的基本组成成分，是甲壳素(chitin)的构成单位。GlcNAc 是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的衍生物，系统命名为 2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，广泛存在于自然界中。其分子式为 C8H15NO6，分子量221.21，一般情况下为白色或微黄色粉末，略有甜味，熔点 200.0 左右。在水中的溶解度比较大，微溶于纯乙醇，也可以作为功能性食品添加剂，但GlcNAc 不具有吸湿性和保湿性7。1%的水溶液是无色透明的。结构式如图 1 所示：图 1 N-乙酰-D-葡萄糖胺的结构简式 Fig.1 Structure formula of N-acetyl-D-glucosamine GlcNAc 是几丁质的单体单元，以-1，4 糖苷键形成线性聚合物。几丁质在自然界的含量仅次于纤维素，常见于蛛形纲动物、昆虫外骨豁、甲壳类动物外壳以及大多数真菌的细胞壁中。最近研究发现几丁质以胞外聚合物的形式存在于在某些微生物中8。GlcNAc 不仅可以组成几丁质等均聚多糖，也可以组成肽聚糖、透明质酸和软骨素等9-12。肽聚糖骨架是由GlcNAc和N-乙酰胞壁酸残基交替相连成的多肽链，是微生物细胞壁的基本组成成分12。1.2.2 GlcNAc 在水溶液中的变旋在水溶液中的变旋 李晓东等通过旋光测定与液质联用的方法，考察了、异构 N-乙酰葡萄糖胺水溶液的变旋平衡过程13(如图 2 所示)：图 2 N-乙酰-D-葡萄糖胺、异构变旋平衡 Fig.2 、heterogeneous mutarotation balance of N-acetyl-D-glucosamine 1.3 GlcNAc 的生理活性的生理活性 生物体内透明质酸、软骨素、硫酸软骨素等的基本组成单位都是由 N-乙酰-D-葡萄糖胺，它们广泛分布于各个组织、软骨和关节液等处。N-乙酰-D-葡萄糖胺特异性地作用于关节软骨，对软骨和关节都有重要作用；N-乙酰-D-葡萄糖胺可以增加皮肤中透明质酸的含量；此外它也是合成 N-乙酰神经氨酸的前体物质。2 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺葡萄糖胺的制备方法的制备方法 2.1 化学合成化学合成 多项研究试验得到 GlcNAc 可以通过酸水解几丁质得到。通过严格调节温度及酸浓度，确保不能破坏 GlcNAc 的结构，从而水解几丁质使其释放出N-乙 酰-D-葡 萄 糖 胺 单 体。Bohlmann 等 用15-36%HCI 在 40-80 温度下处理 1h 可以得到6.42 g/L GlcNAc14。Kohn,P 等通过处理几丁质首先得到葡萄糖胺，接着葡萄糖胺经过乙酰化反应生成 GlcNAc，GlcNAc 的得率可以达到 43%15，通过优化这一乙酰化过程，将葡萄糖胺溶于吡啶中，在三丁胺存在的条件下与酸酐反应生成GlcNAc，其纯度约为99%，GlcNAc 得率也高于 70%。2.2 酶法合成酶法合成 由于技术条件的限制和对环境因素的考虑，化学合成法没有得到广泛应用，酶法水解生产GlcNAc 的条件要求比较温和且选择性强，已经在食品领域得到了应用。N-乙酰-D-葡萄糖胺残基之间的糖苷键可以利用内切几丁质酶随机切割进而产生可溶性的小分子寡糖，随后外切几丁质酶作用催化二糖的释放，最后在 N-乙酰-D-葡萄糖苷酶的作用下得到 GlcNAc。Sashiwa 与 Pichyangkura 等报道了来自不同菌株产生的几丁质酶水解-几丁质生产 GlcNAc，但得率都不高16-17。在酶法合成中，几丁质晶体结构和酶的组分是产生 GlcNAc 的两个决定性因素。由于几丁质的高结晶度限制了酶水解程度，产生 GlcNAc 的效率自然也不高，可以通过开发降低几丁质结晶度的方法来提高 GlcNAc 的纯度和生产效率，这也为产品的生产工艺提供了新的依据。2.3 微生物发酵法微生物发酵法 微生物发酵因其发酵周期短、操作简单、产量高受到了越来越多的关注。土壤中的某些微生物产生几丁质酶可以降解几丁质，Li 等分离到能够降解几 丁 质 的 膝 鼠 气 单 胞 菌Aeromonas caviae DYU-BT4，通过优化发酵过程，利用 2%的胶化几丁质可以产生 7.8 g/L 的 N-乙酰-D-葡萄糖胺，表明可以利用整个微生物产生 N-乙酰-D-葡萄糖胺18。Chen 等人报道了一株可以产生 GlcNAc 的名为Chitinibacter tainanemis 的微生物，该微生物通过产生几丁质降解因子(CDFs)来水解几丁质，且产生的GlcNAc 可以积累不被菌体代谢而提高产物纯度19。此外，也可将葡萄糖作为底物，合成 N-乙酰-D-葡萄糖胺。Deng 等经过多年的研究，通过过量表达葡萄糖胺合酶与葡萄糖胺 6-憐酸酰基转移酶，切断GlcNAc 的代谢途径发酵生产 GlcNAc(如图 3 所示)。后又敲除了编码葡萄糖胺合酶的基因 glmS，过量表达葡萄糖胺6-磷酸脱胺酶Nag和葡萄糖胺6-憐酸乙酷基转移酶 GNA1(如图 4 所示)，构建了一条不依赖于谷氨酰胺的 GlcNAc 合成途径20-21。图 3 重组大肠杆菌合成 GlcNAc 代谢途径 Fig.3 Metabolic pathway for production of N-acetyl-D-glucosamine in recombinant Escherichia coli 图 4 重组大肠杆菌一种新的合成GlcNAc 代谢途径 Fig.4 A new metabolic pathway for production of N-acetyl-D-glucosamine in recombinant Escherichia coli 3 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺的应用葡萄糖胺的应用 N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）是氨基糖家族的主要成员，具有多种生理功能。GlcNAc 及其类似物可以为生物体生长提供碳源和氮源，也可以作为原料转化成生物燃料。此外 GlcNAc 还是蛋白聚糖、糖蛋白、杂多糖和其他粘附组织的组成成分。某些疾病的发生可能与机体不能正常合成和利用氨基糖有关，细胞膜和细胞识别等过程也受GlcNAc 的影响。近年来已经开发了一系列有价值的 GlcNAc 药物以便用于治疗多种疾病。Liu 等通过静脉注射高剂量 GlcNAc，没有引起血糖浓度的改变，也没有发现中毒现象22。进行动物体毒理试验检测，结果显示 GlcNAc 是一种有价值的化合物，无论口服、注射还是外用都可安全使用，目前GlcNAc 已被广泛用作治疗过程中的营养补充23-24。3.1 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺葡萄糖胺在治疗疾病中的在治疗疾病中的应用应用 由上皮细胞组成的消化道粘膜合成的糖蛋白和杂多糖可以保护消化道内壁，炎症性肠道疾病是一系列肠道疾病的统称，是由血管和基质杂多糖炎症紊乱引起的。N-乙酰-D-葡萄糖胺可以促进纤维组织母细胞释放酸性粘多糖，恢复胃肠道保护结构的形成。此外，GlcNAc 可以增加血管周围组织的弹性，增加动脉毛细血管的血流量。在人体内 GlcNAc也可作为细胞保护剂，恢复粘膜的完整性和正常功能25。临床试验 GlcNAc 对炎症性肠道疾病有治疗作用，因此 GlcNAc 可以作为一种廉价的无毒药物用于治疗炎症性肠道疾病。美国、日本等通过临床试验，将氨基葡萄糖硫酸盐和传统药物结合在一起治疗关节炎，得到了很好的疗效，GlcNAc 作为关节液和结缔组织、软骨组织等的组成物质，也具有治疗作用，其作为治疗关节炎的药物并在临床中得到了普遍应用。许多研究证明，GlcNAc 还可以代替塞替派来治疗纤维组织的过度增生，以降低药物治疗的毒副作用；GlcNAc 也具有抗肿瘤及抗感染作用，可以加速伤口愈合，为人造手术线及创伤止血药物提供了科学依据26-28。3.2 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺在食品中的应用葡萄糖胺在食品中的应用 GlcNAc 既是食品添加剂，也是甜味剂，热量低，具有良好的保健效果。美国和日本等已经批准将 GlcNAc 应用到食品中，由于其对血糖升高不起作用，它可以作为糖尿病人和肥胖症患者理想的甜味剂。GlcNAc 和氨基葡萄糖能够刺激肝脏的迷走神经支网，引起全身副交感神经兴奋而使细动脉扩张，增加血流量，使肌肉细胞的氧气、脂肪酸的供量增加，积累在细胞间质的 CO2和水分被排除，pH上升，胰岛素的敏感便会增加，从而能够缓解糖尿病的症状。因此 GlcNAc 可以开发成糖尿病防治食品29。GlcNAc 可以促进双歧杆菌和乳酸菌的生长，因此可以将 GlcNAc 添加到饮料中或制成保健食品可以调节肠道内菌群分布，改变有益菌与有害菌比例，调节肠道的微生态环境。GlcNAc 是一种还原性单糖，具有免疫活性，可用作为食品的抗氧化剂和婴幼儿食品添加剂，也可开添加进抗老化食品和抗肿瘤食品等1。3.3 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺葡萄糖胺在在化妆品化妆品中的应用中的应用 随着科技进步和社会的发展，人民生活水平也不断提高，人们对于美容的要求也越来越高，美容产品也越来越受欢迎。随着年龄的增加，皮肤中粘多糖的量减少，水分减少，弹性变差，进而变得粗糙并且产生细纹，而市场上出售的化妆品中用来补水的产品，大都是短期补水。皱纹的形成和皮肤弹性的降低与透明质酸含量减少有关30，所以近年来开发的化妆品中都含有透明质酸，但是由于透明质酸的分子量大而难以被皮肤吸收。GlcNAc 是透明质酸的组成单位，添加 GlcNAc 可以促进产生透明质酸，促进皮肤成纤维细胞产生骨胶原31。3.4 N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺葡萄糖胺在在合成唾液酸合成唾液酸中中的的应用应用 N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）是合成一种抗流感病毒药物的主要前体物质，衍生物众多，分布也比较广32。Neu5Ac 存在于细胞表面糖蛋白和糖脂末端的唾液