农药登记毒理学试验方法(1)(共83页doc)

……………………………………………………………精品资料推荐………………………………………………… 窗体顶部 中华人民共和国国家标准GB 15670-1995 农药登记毒理学试验方法 Toxicological test methods of Pesticides for registration 1 主题内容与适用范围 本标准规定了农药登记毒理学试验的方法、条件的基本要求。 本标准适用于为农药登记而进行的毒理学试验。 2 急性经口毒性试验 2．1 目的 求出试验农药对试验动物的半数致死剂量（LD50）；通过观察急性毒性效应的临床表现，初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机理；为亚慢性、慢性和其他毒性试验的剂量水平设计提供参考；为急性毒性分级和制定安全防护措施提供依据。 2．2 试验农药 原药和制剂。 2．3 试验动物 2．3．1 主要选用品系、遗传背景明确的初年大鼠。各剂量组内同性别动物体重差异应小于平均体重的10%，组间同性别动物体重均值差异应小于5%。 2．3．2 每一剂量组的大鼠8~10只（雌雄各半），试验前要对动物观察一周，确认健康后，方可使用。 2．4 剂量分组 2．4．1 至少应设4~5个剂量组，各剂量组之间要有适当的剂量间距。以便各组出现不同程度的毒性效应（死亡率），求得剂量效应曲线及LD50。 2．4．2 如剂量达5000mg/kg体重以上，动物仍不出现死亡，则不需要进行更高剂量的试验。 2．5 给药方法及观察时间 2．5．1 动物给药前应隔夜禁食但不禁水，称重后，一次灌胃给药，给药后至少间隔2h进食。 2．5．2 灌胃量 大鼠按100g体重给1mL，小鼠按20g体重给0.4mL计算，灌胃可用水溶液、油溶液或悬液。 2．5．3 给药后立即观察并记录动物的中毒表现，症状出现和消失的时间及死亡时间。给药当日应连续观察，其后，每日至少观察2次，观察期为14d。如在给药96h后出现迟发性新效应，则应延长观察期至3周或4周。 2．6 观察指标 2．6．1 中毒症状 全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官。观察的系统包括： a．中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝； b．植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪； c．呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰； d．泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀； e．皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽； f．眼：眼球突出、结膜充血、角膜混浊； g．消化系统：腹泄、厌食。 2．6．2 体重 给药前、死亡时各称量一次体重，观察期间每3d称量一次。 2．6．3 一般不做病理组织学检查和生化指标检验，但对死亡动物应做大体病理学观察。如24h以上的存活动物，肉眼检查有病变时应做病理组织学检查。 2．7 结果评定 2．7．1 用统计方法计算LD50值。计算方法见附录A（补充件）。 2．7．2 按农药的急性经口毒性分级标准进行评定（见表1）。 表1 急性经口毒性分级标准 级别 经口LD50,mg/kg 剧毒 高毒 中毒 低毒 <5 5-50 50-500 >500 3 急性经皮毒性试验 3.1 目的 了解农药对试验动物皮肤直接接触引起局部皮肤损伤、全身中毒的特征等毒性效应，求出半数致死剂量（LD50），为制定农药生产和应用中的防护措施提供依据。 3．2 试验农药 原药和制剂。 3．3 试验动物 3．3．1 为有足够的涂药面积，首选成年大鼠，体重要求200-300g。 3．3．2 各剂量组大鼠8~10只（雌雄各半）。 3．4 剂量分组 3．4．1 至少应设4个剂量组，各剂量组应有一定的间距，使给药组能出现毒性表现和死亡。 3．4．2 如果2000mg/kg剂量仍不出现死亡时，则不需要再进行高剂量试验。 3．5 给药方法及观察时间 3．5．1 给药前24h背部去毛，注意勿损伤皮肤，涂药面积应占体表面积10%，大鼠4×5cm^2，兔12×14cm^2，豚鼠7×10cm^2。 3．5．2 液体农药用原药液，粉末农药用水或溶剂稀释。 3．5．3 先将动物固定，在略小于剃毛面积内进行定量敷药，然后覆盖一个与脱毛面积相当的盒式罩，再用胶布固定。以防止动物舔食试验药品。 3．5．4 涂药持续时间为4h。 3．5．5 涂药4h后取下罩盒，用温水洗去皮肤上的试验农药，再进行局部观察。 3．5．6 观察时间为2周。 3．6 观察指标 3．6．1 中毒的临床表现，参照2.6.1。 3．6．2 死亡时间及死亡率。 3．7 结果评定 3．7．1 用统计方法计算LD50值。计算方法见附录A（补充件）。 3．7．2 按农药的急性经皮毒性分级标准进行评定（见表2）。 表1 急性经皮毒性分级标准 级别 经皮LD50(4 h),mg/kg 剧毒 高毒 中毒 低毒 <20 20-200 200-2000 >2000 4 急性吸入毒性试验 4．1 目的 测试可能经呼吸道进入机体的农药（尤其是挥发性强的农药）对呼吸道及全身的损伤及其危害程度。求出吸入接触的半数致死浓度（LC50），为农药的安全评价和制定生产应用中的防护措施提供依据。 4．2 试验农药 原药和制剂。 4．3 试验动物 4．3．1 一种以上的哺乳动物，大鼠为首选动物。 4．3．2 动物性别、体重和每组动物数量的要求同2.3。 4．4 剂量分组 4．4．1 至少应设3个出现毒性效应直至死亡的剂量组。 4．4．2 如果以浓度2000mg/m3给药2h仍无死亡，则无需再做高浓度试验。 4．5 给药方法及观察时间 4．5．1 给药方式包括鼻、头部接触和全身置于染毒柜内接触两种方式。 4．5．2 染毒柜内应保持恒定的空气流量、农药浓度、温度及湿度，并要求柜内保持微负以免农药外漏。 4．5．3 吸入给药一般为2h。 4．5．4 给药后至少观察14d。 4．6 观察指标 4．6．1 中毒的临床表现，参照2.6.1。 4．6．2 死亡时间及死亡率。 4．7 结果评定 4．7．1 用统计方法计算LC50值。计算方法见附录A（补充件）。 4．7．2 按农药的急性吸入毒性分级标准进行评定（见表3）。 表3 急性吸入毒性分级标准 级别 LC50(2 h),mg/m^3 剧毒 高毒 中毒 低毒 <20 20-200 200-2000 >2000 5．急性皮肤刺激试验 5．1 目的 测定农药对哺乳动物皮肤是否有刺激或腐蚀作用，估计人体接触该农药时可能出现的类似危害。 5．2 试验农药 原药和制剂。 5．3 试验动物 5．3．1 兔或豚鼠，首选动物为白色家兔。 5．3．2 至少4只皮肤完好的健康动物。 5．4 剂量 5．4．1 一次涂药量为0.5mL或0.5g。 5．4．2 动物自身皮肤做为对照。 5．5 试验步骤 5．5．1 试验前24h将背部毛剪掉，面积约6cm^2。 5．5．2 涂上试验农药，再用纱布盖上，以胶布固定或采用其他封闭性盖罩，避免试验动物舔食。 5．5．3 涂敷持续时间一般为4h。时间结束时，用水或适当的溶剂洗去残留的农药，但注意不要操作皮肤。 5．5．4 根据需要做进一步的观察，以确定反应的可逆性。一般观察期不超过14d。 5．6 结果评定 每一只动物试验结果按表4进行刺激反应评分，计算出平均分值，按表5进行强度评定。 表4 皮肤刺激反应评分 症壮及程序 积分 A 红斑形成 无红斑 勉强可见 明显红斑 中等至严重红斑 紫红色斑并有焦痂形成 B 水肿形成 无水肿 勉强可见 水肿隆起轮廓清楚 水肿隆起轮廓清楚 水肿隆起约1mm 水肿隆起超过1mm，范围扩大 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 总分 A+B 表5 皮肤刺激强度分级 强度 分值 无刺激性 轻度刺激性 中等刺激性 强刺激性 0-0.4 0.5-1.9 2.0-5.9 6.0-8.0 注：pH≤2或pH≥11.5的农药可不进行本试验 6 眼刺激试验 6．1 目的 了解试验农药对眼睛的刺激作用和程度，为农药生产和使用中的安全防护提供依据。 6．2 试验农药 原药和制剂，但对具有强酸、强碱性质的化合物（pH≤2,pH≥11.5）不需做此试验。 6．3 试验动物 成年的白色家兔至少4只。试验前24h检查试验家兔双眼，有异常者不得使用。 6．4 剂量 液体农药或100倍稀释液0.1mL,粒状农药不超过100mg，且应先将颗粒磨成细粉。 6．5 给药方法及观察时间 6．5．1 将一侧下眼睑轻轻下拉，把试验农药滴入结膜囊内，为防止药液外溢，立即轻轻闭合眼睑约1min。如果用喷雾给药法，将眼睑分开，在眼前方10cm距离处迅速喷雾1s。 6．5．2 给药后24h内不洗眼。 6．5．3 对侧眼为对照。 6．5．4 给药后于1，24，48，72h分别检查眼睛。如72h仍无刺激反应时，则终止试验。 6．5．5 如果出现角膜操作或眼睛其他部位出现反应，要继续观察损伤的经过及其可逆性，观察期最长不超过21d。 6．5．6 72h刺激反应仍不消退时，至少另选4只家兔观察洗眼效果。即滴入药物后分别在4s和30s时用生理盐水洗眼5min，观察洗眼后的眼睛反应情况。 6．6 观察指标 除了观察结膜、角膜、虹膜外，还应注意其他部位的损害。 6．7 结果评定 按表6将每只动物的角膜、虹膜和结膜的刺激反应的分值相加，即是一只动物眼刺激反应的总积分。每个动物的刺激反应积分的总和除以动物数，就是该试验农药对眼刺激性的最后分值。再按表7评定眼刺激程度。 表 6 眼损伤程度评分 部位及程度 积分 角膜 A 混浊（以最致密部位为准） 无混浊 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 0 1 续表 6 部位及程度 积分 半透明区易分辩，虹膜模糊不清 出现灰白半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看 清 角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认 B 角膜受损范围 <1/4 1/4-1/2 1/2-3/4 3/4-1 2 3 4 1 2 3 4 最高积分 80(积分AXBX5) 虹膜 正常 邹折明显加深，充血，肿胀，角膜周围有轻度充血，瞳孔对光仍有反应 出血，肉眼可见破坏，对光无反应（或出现其中之一反应） 0 1 2 最高积分 10（积分x5) 结膜 A 充血状态（系指睑结膜、球结膜部位的血管） 血管正常充血 血管充血呈鲜红色 血管充血呈深红色，血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色 B 水肿 无 轻微水肿（包括瞬膜） 明显水肿，伴有部分眼睑外翻 水肿至眼睑近半闭合 C 分泌物 无 少量 分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 最高积分 20[A+B+C)X2] 角膜、虹膜、结膜反应累加最高积分 110(80+10+20) 表7 眼刺激性分级 刺激强度 眼刺激积分指数 (I.A.O.I) 眼刺激的平均指数 (M.I.O.I) 无刺激性 轻度刺激性 轻度至中度刺激性 中度刺激性 中度至重度刺激性 重度刺激性 0-5 5-15 15-30 30-60 60-80 80-110 48h0 48h5 4d5 7d20 7d40 7 皮肤变态反应（致敏）试验 7．1 目的 测试动物在反复接触农药后，机体产生免疫传递的皮肤反应的可能性，从而确定农药的变态反