一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和和AmprTetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法1.原理：原理：pBR322pBR322（1）四环素）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR3222.pBR322抗菌素标记选择产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色蓝灰色）褪色抑制细菌生长，但不杀死细菌抑制细菌生长，但不杀死细菌杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌3）环丝氨酸：）环丝氨酸：3.选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四环素抗性基，导致四环素抗性基因失活，可用因失活，可用四环素加环丝氨酸四环素加环丝氨酸平板培养基选择平板培养基选择重组克隆重组克隆Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
环丝氨酸杀死1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄青霉，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选青霉素指示液选择二、二、二、二、-半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1.原理：原理：载体载体上有一段上有一段 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z）的）的）的）的 片段（氨片段（氨片段（氨片段（氨基端），其上有外源基端），其上有外源基端），其上有外源基端），其上有外源DNADNA的插入位点的插入位点的插入位点的插入位点受体菌基因组受体菌基因组受体菌基因组受体菌基因组中中中中有突变的有突变的有突变的有突变的 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片段缺失）可以被片段缺失）。
可以被片段缺失）可以被片段缺失）可以被IPTGIPTG诱导表达诱导表达诱导表达诱导表达载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互补互补互补互补形成完形成完形成完形成完整有功能的整有功能的整有功能的整有功能的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶假阳性：假阳性：如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数并且没有中的倍数并且没有中止密码；（不破坏止密码；（不破坏 肽）2.选择过程选择过程-半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物分解成兰色产物利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直接选特性进行直接选择只在特定条件下）只在特定条件下）转化进来的外源基因产物能够弥补受体转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷菌株的突变型缺陷一、原理：一、原理：第二节第二节 根据插入基因的表型选择根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的培在不含组氨酸的培养基中生长养基中生长小鼠的二轻叶酸还原酶（小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。
二氨嘧啶有抗性DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧啶三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型使被转化的受体菌表现出外源基因的表型2.增加新性状增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大载体分子量大一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较分离质粒，电泳、比较其分子量其分子量第三节第三节 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker载体载体重组克隆重组克隆二、酶切电泳筛选法1.原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（较电泳结果（DNA带数和长度）带数和长度）或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果ABA或或B不同克隆的酶切结果不同克隆的酶切结果筛选过程筛选过程三、PCRPCR扩增检测法1.原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
片断2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR3）电泳）电泳PCR产物4）检查是否有）检查是否有PCR产物5）PCR产物的长度是否与外源基因一致产物的长度是否与外源基因一致1.核酸核酸杂交杂交第四节 核酸杂交检测法 一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交重组克隆与探针杂交3.识别标记识别标记32P 或或 125I1）放射性同位素）放射性同位素2.检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列插入片断互补的序列2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素二、核酸杂交检测方法用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品1.Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），（或质粒载体），再用探针杂交再用探针杂交只有带有插入片断的重组载体才能与探只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示针杂交，在底片上曝光显示酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体Southern Southern blot blot 筛选筛选结果结果（1）原位杂交筛选）原位杂交筛选特点：特点：特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。
以直接找出阳性菌落2）R-环检测法环检测法DNA-RNA杂交1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复性双链变性，复性的时候，的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双双链更稳定电镜下可见一种链更稳定电镜下可见一种R-环形结构环形结构用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交与重组载体杂交缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！2.Northern blotting用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样样品主要检测插入片断主要检测插入片断是否被转录是否被转录从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂，再用探针杂交利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌并来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因且表达出相应的蛋白质的外源基因根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法第五节 免疫化学检测法 1.抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测对表达产物的检测。
蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2.2.放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程3.Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白检测融合蛋白既检测外源基因产物又检测载体基因产物既检测外源基因产物又检测载体基因产物固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。
1.原理原理抗原抗原抗体凝集反应抗体凝集反应检测分泌型产物检测分泌型产物2.方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISAELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1.原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合与目标分子的特异结合二抗（二抗（secondary antibody）：）：与一抗的特异性结合与一抗的特异性结合酶连（酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量度），从而推测目标分子的含量待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 192.ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤检测的一般步骤检测的一般步骤（1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被）的孔中，干燥后就被固定在固定在孔底孔底。
孔底孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体2 2）一抗结合）一抗结合）一抗结合）一抗结合一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉二抗只识别一抗二抗只识别一抗二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）酶、脲酶等）3 3）二抗结合）二抗结合）二抗结合）二抗结合二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）反应转变成有色物质（或发光）4 4）显色反应）显色反应）显色反应）显色反应在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比。