生物无机化学第四章含铁氧载体第节

节蚯蚓血红蛋白(Hr)自然界除了含具有血红素辅基的血红蛋白和肌红蛋白氧载体之外，还有一类含有铁但不含血红素辅基的氧载体蚯蚓血红蛋白(Hr)。血红素氧载体Hb、Mb广泛存在于动物及部分植物体系中，而非血红素氧载体Hr只存在于无脊椎动物中。与血红蛋白和肌红蛋白相比，蚯蚓血红蛋白的研究要晚得多，其晶体结构直到20世纪90年代才见报道。目前从无脊椎动物的肌肉中分离得到了蚯蚓血红蛋白的单体，称为肌蚯蚓血红蛋白。从无脊椎动物的血液中分离得到的是由八个亚基组成的分子质量为108000 Da的多聚体。一、蚯蚓血红蛋白的结构 到目前为止，已经报道的蚯蚓血红蛋白的晶体结构有：氧合和脱氧蚯蚓血红蛋氧合和脱氧蚯蚓血红蛋白白、高铁蚯蚓血红蛋白高铁蚯蚓血红蛋白、叠氮高铁蚯蚓血叠氮高铁蚯蚓血红蛋白红蛋白。晶体结构显示蚯蚓血红蛋白每个亚基中含有一个由两个铁原子组成的活性中心，两个铁原子通过一个氧桥（氧合状态）或羟桥（脱氧状态）和两个分别来自于蛋白链中天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)侧链的羧酸根桥联在一起，称为双铁活性中心。脱氧蚯蚓血红蛋白的双铁活性中心氧合蚯蚓血红蛋白的双铁活性中心 每个铁原子除了与起桥联功能的氧原子配位外，还与蛋白链中组氨酸侧链的咪唑氮原子配位，其中一个铁原子与三个咪唑氮原子配位形成六配位的八面体构型，而另一个铁原子只与两个咪唑氮原子配位，配位数只有五，剩余的一个位置为空位或被水分子占据。蚯蚓血红蛋白的氧合作用就发生在该空位上。叠氮高铁蚯蚓血红蛋白中铁的空位被叠氮根离子占据，叠氮根离子以端式形式与铁原子配位。由于一个活性中心有两个铁原子存在，所以根据铁原子化合价的不同，蚯蚓血红蛋白至少有三种状态：(1)Fe(II)-Fe(II)脱氧情况下的还原态；(2)Fe(III)-Fe(III)高铁蚯蚓血红蛋白；(3)Fe(II)-Fe(III)半高铁蚯蚓血红蛋白。在半高铁蚯蚓血红蛋白中，因为两个铁原子的配位环境不同，所以半高铁蚯蚓血红蛋白实际上包含Fe1(II)-Fe2(III)和Fe1(III)-Fe2(II)两种不同的状态。Fe1Fe2二、蚯蚓血红蛋白的氧合作用 虽然目前分离得到的蚯蚓血红蛋白中多数为含有八个亚基的多聚体，但是大部分蚯蚓血红蛋白的载氧过程中并没有观察到与血红蛋白载氧过程相似的协同效应。在氧合和脱氧蚯蚓血红蛋白的晶体结构报道之前，科学家已经利用化学和物理等方法研究蚯蚓血红蛋白的氧合过程，例如利用共振拉曼光谱研究并推测了氧分子与双铁活性中心的结合方式以及结合后氧的存在形式。氧分子与双铁活性中心结合至少有五种方式，其中(a)、(b)、(c)三种方式中两个氧原子是等价的，而(d)和(e)两种方式中两个氧原子是不等价的。利用16O18O不对称标记的氧分子与脱氧蚯蚓血红蛋白作用，然后测其共振拉曼光谱。如果拉曼光谱中只有一种OO振动吸收，表明氧分子的配位方式是(a)、(b)、(c)三种方式中的一种。如果光谱中有两种OO振动吸收，表明是(d)、(e)两种方式中的一种。实际用16O18O标记过的氧合蚯蚓血红蛋白的共振拉曼光谱中确实观测到了一个双重峰，利用结构模型计算得到Fe-16O18O和Fe-18O16O中O-O振动吸收分别在825 cm-1和819 cm-1。而氧合蚯蚓血红蛋白中Fe-16O2的O-O振动吸收为846 cm-1。实验结果与理论结果一致，说明在氧合蚯蚓血红蛋白中，氧分子以(d)或(e)的方式与双铁中心配位。结合其它光谱数据推测结合方式为(d)。从氧合蚯蚓血红蛋白的共振拉曼光谱研究中也可以推测氧合后氧分子的存在方式。氧合蚯蚓血红蛋白的O-O振动吸收出现在846 cm-1，是过氧负离子过氧负离子的特征振动吸收。O 氧分子与蚯蚓血红蛋白结合后，两者之间发生了双电子氧化还原反应双电子氧化还原反应，两个铁原子从二价被氧化到三价，而氧分子则被还原为负二价的过氧负离子。光谱分析表明，脱氧状态下的蚯蚓血红蛋白中铁原子为二价高自旋，两个铁原子间通过羟桥存在弱的反铁磁性相互作用。氧分子以端式方式结合到五配位铁原子上后，生成了三价高自旋铁的过氧配合物，过氧负离子从羟桥上接受一个质子，羟桥变为氧桥。结论：在氧合蚯蚓血红蛋白中，氧分子以过氧负离子的形式以端式配位方式与一个铁离子配位。第三节 重要模型化合物合成氧载体 除了对天然金属蛋白本身的研究之外，模型化合物的研究也是生物无机化学研究中非常重要的组成部分。一方面，由于金属蛋白等生物分子的相对分子质量一般较大、体系比较复杂，需要通过简化、设计合成模型化合物等方法来进行研究，可以得到一些通过直接研究金属蛋白分子本身不能得到的信息，揭揭示蛋白功能与结构之间的关系示蛋白功能与结构之间的关系。另一方面，通过模拟天然金属蛋白的结构和功能，为进一步开发利用天然蛋白及其模型化合物提供基础。在氧载体研究中，模型化合物的合成及其结构和功能间关系的研究特别重要，它可以为阐明载氧过程及载氧机理提供依据，并为合成具有实际应用价值的具有载氧功能的化合物（人造血液）等提供基础。有关合成氧载体的研究很早就受到科学家的重视，早期工作主要集中在含席夫碱席夫碱配体的非铁配合物。如1938年就发现Co(II)的双水杨醛缩乙二胺配合物可以结合分子氧，结合氧分子之后其颜色由红棕色变为黑色。但是模拟氧载体的研究中更多的还是含铁和卟啉以及含双核铁的配合物，分别模拟天然血红蛋白、肌红蛋白和蚯蚓血红蛋白。一、血红蛋白和肌红蛋白的模拟研究 为了模拟天然血红蛋白和肌红蛋白的活性中心，科学家合成了许多含铁的卟啉配合物。初期的研究主要集中在简单的铁卟啉配合物，如Fe(TPP)(N-MeIm)，其中TPP为内消旋四苯基卟啉，N-MeIm为N-甲基咪唑。研究结果发现简单的铁卟啉配合物不能可逆地结合氧分子，而是发生下列反应：最后生成通过氧桥联的双铁物种，即发生了氧化二聚反应氧化二聚反应。从氧化还原电位可以看出，氧分子的氧化能力相当强，当其与还原态的血红素铁结合时，很容易将二价铁氧化到三价铁，并最终形成稳定的通过氧桥联的双铁物种。要实现可逆结合氧分子，并模拟血红蛋白和肌红蛋白的载氧功能，首先必须阻止氧阻止氧化二聚反应化二聚反应的发生，即如何避免双核铁配合物的形成是成功合成铁卟啉人工氧载体的关键。利用空间阻碍空间阻碍、低温低温以及刚体支撑刚体支撑等方法可以成功地合成含铁卟啉的人工氧载体。1、空间阻碍方法 空间阻碍方法就是设计和合成具有立体阻碍基团的卟啉合铁配合物PFe(II)，利用其空间位阻效应使PFe(II)与O2反应时只能生成PFe(II)O2，而阻碍桥联双核物种PFe(III)-O-O-Fe(III)P的生成。Collman等提出的篱笆式（或栅栏式）卟啉铁模型：5,10,15,20-四（邻三甲基乙酰胺苯基）卟啉合铁Fe(TpivPP)以Fe(TpivPP)为基础，合成的配合物Fe(TpivPP)L（L=咪唑及其衍生物），可以与O2可逆地加合，生成Fe(TpivPP)LO2。由于篱笆的保护，Fe(TpivPP)LO2不能发生二聚反应，从而成功得到了第一个在室温下的含铁的合成氧载体。Fe(TpivPP)LO2具有和氧合血红蛋白相同的抗磁性，相同的四极分裂穆斯堡尔谱，相同的O-O拉曼吸收1159 cm-1。该模型配合物很好地模拟模拟了血红蛋白和肌红蛋白的载氧功能。帽式铁卟啉配合物也可以利用空间位阻效应来模拟载氧功能。由于帽子的存在可以有效地防止双核铁物种的形成，并提供一个口袋，使氧分子能与中心铁离子作用。2、低温方法 利用低温方法，可以稳定双氧配合物、降低不可逆氧合的速度。例如，四苯基卟啉（TPP）合铁配合物在低温（45）下与氧分子反应时，反应受动力学控制，抑制了热力学有利的二聚反应，从而实现了可逆的载氧过程。提高温度则生成不可逆氧化产物。3、刚体支撑方法 刚体支撑方法是将容易发生氧化二聚反应的卟啉合铁配合物接在固体表面或高分子表面，使两个铁原子不能相互靠近，从而达到阻止二聚体形成的目的。将1-(2-苯乙基)咪唑血红素埋入聚苯乙烯和1-(2-苯乙烯)咪唑的混合物的薄膜中，氧分子即可与固定的配合物可逆地结合。Fe(TPP)B2混在由3-咪唑丙基的改性硅胶中，加热生成(IPG)Fe(TPP)后也可以与氧分子可逆结合。二、蚯蚓血红蛋白的模拟研究 因为蚯蚓血红蛋白的活性中心是由双核铁构成的，所以模型化合物主要是各种含有羧酸根桥联的双核铁配合物双核铁配合物。根据活性中心铁离子价态的不同，双铁活性中心有三种状态：Fe3+-Fe3+（高铁高铁）、Fe3+-Fe2+（半高铁半高铁）、Fe2+-Fe2+（还原态还原态）。不同氧化态有不同的模型化合物。1、Fe3+-Fe3+高铁模型化合物 作为高铁蚯蚓血红蛋白双铁活性中心的模型，20世纪80年代Lippard和Wieghardt两个课题组分别报道了含有Fe2IIIO(OOCR)2骨架的双核铁配合物。HBpz3-为氢化三(吡唑基)硼酸根图4.14 Fe2IIIO(OAc)2(HBpz3)2的晶体结构 这类模型化合物具有和高铁蚯蚓血红蛋白非常相似的特征吸收光谱，Fe3+-Fe3+之间有强的反铁磁性相互作用，很好地模拟了高铁蚯蚓血红蛋白双铁活性中心的结构和谱学性质。2、Fe2+-Fe2+还原型模型化合物 作为还原型蚯蚓血红蛋白模型的Fe2+-Fe2+配合物很少有报道。配合物Fe2IIO(OAc)2(TACN)2是其中的一例。其中TACN为N,N,N-三甲基三氮杂环壬烷。3、Fe3+-Fe2+半高铁模型化合物 将Fe3+-Fe3+高铁模型化合物进行单电子还原，可以得到半高铁蚯蚓血红蛋白模型化合物，但由于具有氧桥或羟桥的Fe3+-Fe2+混合价的双核铁配合物非常不稳定，到目前还没有被合成并分离得到。尽管蚯蚓血红蛋白模型化合物的结构与天然蚯蚓血红蛋白双铁活性中心的结构、谱学性能非常接近，是好的结构模型结构模型。但是这些模型化合物中铁离子都是配位饱和的六配位八面体构型，而天然蚯蚓血红蛋白双铁活性中心在脱氧状态下其中一个铁离子为配位不饱和的五配位构型，剩下的一个空位用于结合氧分子。因此这些模型化合物没有结合没有结合氧分子的能力氧分子的能力。第四节 人造血液 世界各国的化学家和生物学家很早就致力于合成类似血红蛋白结构并具有载氧生理功能的人造血液研究，以满足外科手术、战地救护、失血过多病人和血液病患者的需要。接近真血液功能的人造血液至今未能获得成功，但是对一类氟碳化合物氟碳化合物人造血液的研究取得了一定的进展。这项研究始于20世纪60年代，美国科学家偶然发现氟碳化合物具有良好的载氧功能。1979年日本率先在临床应用获得成功。作为人造载氧血液主要成分的氟碳化合物有：全氟醚全氟醚、全氟三丁基胺全氟三丁基胺、全氟萘全氟萘烷烷、全氟甲基萘烷全氟甲基萘烷等。此外，人造血液中还含有甘油、NaCl、KCl、CaCl2、Na2CO3和葡萄糖等物质。经大量动物试验证明，在富氧条件下，氟碳化合物传递氧气和二氧化碳的速度比血红蛋白还要迅速，它的物理化学性质稳定，无毒，不致癌。但由于它不含白血球、血小板、抗体、酶、蛋白质、氨基酸等生物物质，所以它没有抗菌、凝血、免疫、营养、输送金属离子等生理功能。我国自主研发的“人工血液代用品”已经取得了突破性进展，现已进入I期临床试验阶段。该人工血液为聚乙二醇牛血红蛋聚乙二醇牛血红蛋白偶联物白偶联物，是以牛血红蛋白为基质的携氧剂与血容量扩容剂，使用时不用分A、B、AB和O血型。本章小结：通过对含铁氧载体的血红蛋白、肌红蛋白、蚯蚓血红蛋白的结构、载氧方式和机理的学习，以及模型化合物的研究，熟悉血红蛋白、肌红蛋白、蚯蚓血红蛋白的载氧功能，重点掌握蛋白活性中心的配位结构、氧分子的结合方式和存在形式。