章章食品微生物检验的常用试剂及配制食品微生物检验的常用试剂及配制了解染色的基本原理掌握常用染料的性质及其染色的配制技术熟悉常用试剂、缓冲溶液、物质的量浓度的配制技术了解培养基的种类及一些常见培养基的用途，掌握一般培养基的配制技术第一节 染料及染液配制技术一、染色原理 微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等化学因素：正负离子之间的相互吸引等二、染料的种类 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1.酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑、苦味酸等2.碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色3.中性（复合）染料：如伊红美兰等，瑞脱氏染料和基姆萨氏染料等（常用于细胞核染色）4.单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类的染料 三、常用染液的配制1.常用染料的溶解度 表3-12.常用染料的配制 第二节常用试剂的配制技术一、缓冲液的配制技术 一、缓冲溶液及其缓冲作用一、缓冲溶液及其缓冲作用（一）、缓冲溶液的概念和组成（一）、缓冲溶液的概念和组成13141L纯水纯水pH=7+1mL1.0mol/L的的HCl溶液后溶液后,pH=3+1mL1.0mol/LNaOH后，后，pH=111L0.1mol/L的的HAc和和NaAc溶液溶液pH=4.76+1mL1.0mol/L的的HCl溶液后溶液后,pH=4.75+1mL1.0mol/LNaOH后，后，pH=4.771L0.1mol/L的的NH3和和NH4Cl溶液溶液pH=9.26+1mL1.0mol/L的的HCl溶液后溶液后,pH=9.25+1mL1.0mol/LNaOH后，后，pH=9.27（一）、缓冲溶液的概念能抵抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释，能抵抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释，而保持其而保持其pH相对稳定的溶液相对稳定的溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液对强酸、强碱或稀释的抵抗作用缓冲溶液对强酸、强碱或稀释的抵抗作用缓冲作用缓冲作用三、缓冲溶液作用原理及分类1、缓冲作用原理：同离子效应同时含有能够抵抗外来的、少量酸的成分，和能够抗外来的、少量碱的成分。
这两种成分被称为缓冲对或缓冲系能够对抗外来少量酸的成分被称为抗酸成分；能够对抗外来少量碱的成分被称为抗碱成分以以HAcNaAcHAcNaAc缓冲体系为例：缓冲体系为例：HAcH+Ac因因NaAc的同离子效应的同离子效应抑制了抑制了HAc的解离的解离体系中存在大量体系中存在大量HAcHAc和和AcAc在在HAcNaAc缓冲体系中加入少量强酸时：缓冲体系中加入少量强酸时：HAcH+Ac+外来外来H+平衡移动方向平衡移动方向平衡移动结果：外来平衡移动结果：外来H+被消耗溶液被消耗溶液pH没有明显没有明显降低降低抗酸缓冲作用抗酸缓冲作用在在HAcNaAc缓冲体系中加入少量强碱时：缓冲体系中加入少量强碱时：平衡移动结果：外来平衡移动结果：外来OH被消耗HAc解离补充了消解离补充了消耗的耗的H，pH没有明显升高没有明显升高抗碱缓冲作用抗碱缓冲作用HAcAc+H+HAcH+Ac-pH基本不变基本不变OH-H+抗碱成分抗碱成分抗酸成分抗酸成分 HAc HAc HAc HAcNaAcNaAcNaAcNaAc的缓冲机制的缓冲机制的缓冲机制的缓冲机制二、物质的量浓度溶液的配制技术1.溶液浓度表示法2.物质的量浓度溶液的配制方法3.溶液浓度的调整4.常用酸碱的物质的量浓度计算（一）物质的量浓度（一）物质的量浓度（mol/L）SI单位：单位：molL-1（二）质量分数（二）质量分数nBc cB B V=1.溶液浓度的表示方法（三）质（三）质量量浓浓度（度（kg/L）mBB B V V=SI单位：单位：kgL-1药典中常采用这种浓度的表示方法药典中常采用这种浓度的表示方法（四）体积分数（四）体积分数（五）质量摩尔浓度（五）质量摩尔浓度（mol/kg）SI单位：单位：molkg-1特别要注意的是特别要注意的是:指每指每1kg1kg溶剂中含溶质的溶剂中含溶质的物质的量物质的量.nBb bB B mA=物质的量浓度溶液的配制物质的量浓度溶液的配制小组讨论：小组讨论：如何配制如何配制5050克溶质质量分数为克溶质质量分数为10%10%的氯化钠溶液的氯化钠溶液？如何配制如何配制1mol/L1mol/L氯化钠溶液？氯化钠溶液？溶液浓度的调整溶液稀释计算基本原则：稀释前后物质的量不变基本公式C1V1=C2V2C1：稀释前溶液的浓度C2：稀释后溶液的浓度V1：稀释前浓溶液的体积V2:稀释后溶液体积例子若配制75%消毒乙醇800ml，需取95%乙醇多少ml？若配制75%乙醇700ml，应取95%及60%乙醇各多少ml？练习例1：用质量分数60%的酒精溶液A与质量分数为25%的酒精溶液B配成质量分数为45%的酒精溶液。
所用A/B的质量比是多少？例2：若将100g20%的某溶液的浓度降到5%，需要加水多少？例3：含氨15%的氨水2千克，稀释到含氨0.3%时需加水多少？例4：把50g硫酸溶液溶质质量分数98%的稀释成20%的硫酸溶液，得到20%溶液多少克？溶液组成表示方法之间的换算溶液组成表示方法之间的换算三、pH指示剂的配制技术记住变色范围及颜色变化四、血清学反应试剂制备技术抗凝剂的制备佐剂的配方及配制方法ELISA常用试剂的配制抗血清的制备抗凝剂的制备在医学实验中常需动物的全身抗凝，采出的全血或血浆有的也需加入适当的抗凝剂抗凝对抗凝剂的要求是：用量少、溶解度大、不带进干扰实验的杂质1.阿氏血液抗凝剂是一种红细胞保存液，含有抗凝剂柠檬酸钠和细胞需要的养分葡萄糖阿氏液配方如下：葡萄糖2.05克、柠檬酸钠0.8克、柠檬酸0.055克、氯化钠0.42克加蒸馏水至100毫升，加热溶解后将pH值调到6.1，经过69千帕，15分钟的高压灭菌，放置在4的环境内，保存备用2.草酸钾草酸钾为最常用的抗凝剂其与血液混合后可迅速与血液中的钙离子结合，形成不溶解的草酸钙，使血液不凝固常用于非蛋白氮测定，但不适用于测定钾和钙取草酸钾10g，加蒸馏水少许使溶解，再加蒸馏水至100ml。
配制成10水溶液，如每管加0.1ml则可使510ml血不凝一般如作微量检验，用血量较少，可配制成2溶液，如每管加01ml可使12ml血液不凝3.肝素肝素的抗凝作用很强,作死亡复苏等实验时,常用它作动物全身抗凝剂，肝素的抗凝作用主要是抑制凝血致活酶的活力，阻止血小板凝聚以及抑制抗凝血酶等作用，从而使血液不发生凝固注意事项：做全血DNA提取的时候抗凝剂不能采用肝素！因为肝素是聚合酶链式反应的抑制剂！佐剂的配方及配制方法佐剂是免疫学和生物制品学中的一个重要内容对增强机体对抗原的免疫应答，提高生物制品的免疫效应发挥着重要作用什么是什么是“佐剂佐剂”呢？呢？佐剂概念与分类佐剂是指与抗原物质混合或先于抗原或同时注入动物体内，能非特异性地增强机体对抗原物质的免疫应答的一类物质也称为免疫佐剂、抗原佐剂矿物质类佐剂（氢氧化铝胶、磷酸铝胶）油类佐剂（弗氏佐剂、矿物油佐剂）微生物佐剂弗氏佐剂弗氏不完全佐剂由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂弗氏完全佐剂是在不完全佐剂的基础上加一定量的分支杆菌而成虽然具有一定副作用，但其佐剂活性是其他物质难于相比的石蜡油+羊毛脂+卡介苗混合分装保存ELISA常用试剂的配制采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。
测定的对象可以是抗体也可以是抗原优点：灵敏性高特异性强抗血清制备抗原：能与T细胞受体(TCR)及B细胞受体(BCR)结合，促使其增殖、分化，产生抗体和(或)致敏淋巴细胞，并能与之特异性结合，进而发挥免疫效应的物质抗原特性：1、免疫原性2、免疫反应性抗血清制备抗体：B细胞受抗原刺激后转化成浆细胞产生的,能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白抗体主要存在于血清中多次注射抗原，使血清中抗体量达到要求浓度，采集血液，从血液中分离血清，得抗血清免疫系统的组成及功能免疫系统的组成及功能免疫器官免疫器官免疫细胞免疫细胞免疫分子：抗体、补免疫分子：抗体、补体体免疫应答免疫应答固有免疫应答固有免疫应答适应性免疫应答适应性免疫应答免疫效应免疫效应生理效应生理效应抗感染免疫抗感染免疫抗肿瘤免疫抗肿瘤免疫免疫耐受免疫耐受病理效应病理效应超敏反应超敏反应自身免疫病自身免疫病免疫缺陷病免疫缺陷病免疫学应用免疫学应用:免疫诊断、免疫治疗、免疫预防免疫诊断、免疫治疗、免疫预防抗抗原（引起免疫应答的物质）原（引起免疫应答的物质）抗血清制备1、抗原制备2、免疫家兔3、采试血4、采全血5、抗血清的分离、保存鞭毛抗原的制备库斯塔克亚种、蜡螟亚种(青虫菌)、加拿大亚种及分离的苏云金芽胞杆菌。
移接到牛肉膏蛋白胨斜面上培养1夜，再用稀释分离法或划线分离法获得单个菌落；当运动性细菌扩散到距离平板边缘数毫米时，用接种环取最外边菌体，接种于另一软琼脂平板的中央如此移接4-6次，最后一次则取最外边菌体接种子摇瓶，2830振荡培养10-14h鞭毛抗原的制备培养液离心，去上清液，再悬浮于50mL含0.25的福尔马林生理盐水中，再离心15min，去上清液，将收集的菌体悬浮在10mL含0.25福尔马林生理盐水中，制成抗原母液，置冰箱保存备用保存抗原液使用期为4周菌体抗原制备将鞭毛抗原母液分出一半，装入带棉塞的无菌空试管中，置沸水中加热1h，待冷却后即为去掉鞭毛的菌体抗原放入冰箱保存备用免疫家兔免疫前从家兔身上采集少量血液，作为对照血清(采集方法和静脉注射相似，将兔子固定，用注射器针头对准耳朵边缘静脉末梢附近插入慢慢抽出血液约3mL，分离血清)定期定量注射抗原采试血注射最后一次一周后采试血约3mL，方法同采对照血清当试血效价达到1：2000以上，则可采全血，否则要加强注射1-2次采全血1)心脏采血采血当天早上不喂饲料一只2kg以上的兔可抽血100mL以上2）颈动脉放血采血后的注意事项：由于血液会立即凝固，因此，采血后的注射器和针头要立即用生理盐水抽吸几次并将取下的针头和简芯连同剪刀、止血钳、镊子等一起泡进生理盐水中，洗净后煮沸消毒备用。
抗血清的分离、保存将三角瓶的血液斜置0.5-1h后(室温或37温箱)，再将三角瓶立起，并用无菌细玻棒沿瓶壁将血块与瓶壁分离，转入冰箱过夜，让血清充分析出，用无菌吸管和毛细滴管分出血清若血清中带有红血球，则须装入无菌离心管中离心将血清吸入无菌三角瓶，去掉红血球五、生化试剂制备技术及试验法什么是微生物生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验由于细菌各自酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌细菌的生化反应检查法1.1.在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的pHpH值变化2.2.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应3.3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在根据酶作用的反应特性，测定酶的存在4.4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
生化试验的注意事项1.待检菌应是新鲜培养物培养18-24h2.待检菌应是纯种培养物3.遵守观察反应的时间观察结果的时间，多为24或48小时4.应做必要的对照试验5.提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验一）糖（醇）类代谢试验（一）糖（醇）类代谢试验 1、V-P试验试验2、甲基红（、甲基红（Methyl Red）试验）。