实验动物胚胎工程教程课件

动物胚胎工程动物胚胎工程 管敏强 温州医科大学实验动物中心第一节第一节 动物胚胎工程概述动物胚胎工程概述1.1.概概念念2.2.研研究的究的对象象细胞动物体外体内一、概一、概 述述（一）概念（一）概念 胚胚胎胎移移植植（embryo transfer，ET）：又又称称受受精精卵卵移移植植，是是将将体体内内或或体体外外生生产产的的哺哺乳乳动动物物早早期期胚胚胎胎移移植植到到另另一一头头同同种种的的生生理理状状态态相相同同的的雌雌性性动动物物生生殖殖道道内内，使之继续妊娠发育为新个体的技术，也称使之继续妊娠发育为新个体的技术，也称借腹怀胎借腹怀胎。提供胚胎的个体提供胚胎的个体供体（供体（donor）接受胚胎的个体接受胚胎的个体受体（受体（recipient）工程之一工程之一 胚胎移植技术胚胎移植技术为了使供体为了使供体多排卵，通常采用多排卵，通常采用超排超排（superovulation）；）；国外将常规的胚胎移植称为国外将常规的胚胎移植称为超数排卵胚胎移超数排卵胚胎移植或称为多排卵胚胎移植（植或称为多排卵胚胎移植（multiple ovulation and embryo transfer，MOET）；）；目前，用目前，用体外生产胚胎（体外生产胚胎（in vitro production,IVP）技术或克隆（）技术或克隆（cloning）技术）技术等方法也可等方法也可以生产胚胎，扩大了优质胚胎的来源，降低以生产胚胎，扩大了优质胚胎的来源，降低了了ET的成本。的成本。二、胚胎移植历史二、胚胎移植历史 胚胎移植技术是人类基于对哺乳动物个体发生、发育规律认识的基础上，通过大量实验研究和生产应用，逐渐发展起来的一项胚胎技术。1890年剑桥大学年剑桥大学Walter Heape从一头纯种安从一头纯种安哥拉母兔取出哥拉母兔取出2个个4细胞胚胎，移植到一头纯细胞胚胎，移植到一头纯种比利时母兔输卵管上端种比利时母兔输卵管上端(用同种公兔交配后用同种公兔交配后3h),结果生出了结果生出了4只比利时种仔兔和只比利时种仔兔和2只纯种只纯种安哥拉仔兔。安哥拉仔兔。这一结果说明早期发育的胚胎更换到另一个体的输这一结果说明早期发育的胚胎更换到另一个体的输卵管卵管(或子宫角或子宫角)内，如果胚胎的发育阶段和所处的内，如果胚胎的发育阶段和所处的环境条件相适应，它完全可以继续正常发育，并成环境条件相适应，它完全可以继续正常发育，并成长为一个新个体。长为一个新个体。国外胚胎移植技术的发展历史作者及年代事例动物Heape,1890Nicholas,1933Warwick,1949Kvansnickii,1951Willett,1951Marden 和Chang,1952Whittingham,1972国际胚胎移植学会成立,1975Steptoe，1978Newcomb和Elsden，1979首次胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功首次胚胎洲际运输(保存在100C)经长期冷冻,胚胎移植并产仔胚胎移植成功使用卡苏输精器兔大鼠绵羊和山羊猪牛兔牛人牛我国胚胎移植技术的发展历史动物事例动物陈玉琦,1973中科院遗传所,1974中科院遗传所,1976谭丽玲,郭志勤等,1976中科院遗传所,1979王建辰等,1980王运京等,1980中国农科院畜牧所,1980张涌等,1987谭丽玲,马世援等,1989郭志勤等,1989胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎低温保存(100C)产仔胚胎低温保存(100C)产犊-1960C保存胚胎产仔胚胎移植成功非手术法胚胎移植成功-1960C保存胚胎产羔胚胎分割移植成功鲜胚分割移植成功冻胚分割移植成功兔绵羊兔绵羊兔奶山羊奶牛绵羊奶山羊奶牛奶牛三、胚胎移植的意义科研用途：1.转基因动物、基因敲除动物和克隆动物、核移植、胚胎切割、体外受精等获得目的动物 2.动物的微生物净化 其它用途：1.稀有品质动物的扩群（如高产奶牛和濒危动物)2.不孕不育症的治疗(显微受精)四、胚胎移植的生理学基础与基本原则四、胚胎移植的生理学基础与基本原则（一）生理学基础（一）生理学基础（一）生理学基础（一）生理学基础（二）胚胎移植遵（二）胚胎移植遵（二）胚胎移植遵（二）胚胎移植遵 循的基本原则循的基本原则循的基本原则循的基本原则 （三）开展胚胎移植（三）开展胚胎移植（三）开展胚胎移植（三）开展胚胎移植 的条件的条件的条件的条件雌性动物发情后生殖器官的孕向发育1早期胚胎处于游离状态2移植的胚胎具有免疫耐受性341.胚胎移植的生理学基础 胚胎的遗传特性不受受体雌性动物的影响2.胚胎移植的基本原则胚胎移植前后所处的环境的同一性同一解剖位置：空间环境的一致性同一生理阶段：受体和供体在发情时间上的同期性 同一物种：供体和受体在分类学上的相同属性胚胎的 发育期限必须处于周期黄体期内。胚胎的 质量胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响。实验室条件实验室条件 温度恒定、温度恒定、空气洁净、空气洁净、布局合理；布局合理；技技 术术 条条 件件胚 胎 来 源包括人员包括人员的技术水的技术水平及所需平及所需的设备；的设备；从优良雌从优良雌性动物获性动物获得大量胚得大量胚胎。胎。3.开展胚胎移植的条件开展胚胎移植的条件五五、胚胎移植的基本步骤、胚胎移植的基本步骤供、受体的选择供、受体的选择供体的超数排卵供体的超数排卵受体的同期发情受体的同期发情胚胎的收集胚胎的收集胚胎的检查和评定胚胎的检查和评定胚胎的移植胚胎的移植1.供体和受体的选择供体和受体的选择n供体 具有遗传优势，在育种上有相当高的育种价值；具有良好的繁殖能力，无生殖道疾病，；体质强健，健康无病，营养良好的雌性动物作供体；n受体 应繁殖性能好，对地方适应性强，容易购买，体型中上等的雌性动物；受体健康状况良好，已进入发情季节；n供、受体发情时间应接近或一致2.2.超数排卵超数排卵 超数排卵是一种不正常的排卵，经外源激素处理的雌性动物，可以改变性周期，可以超常数的排卵，甚至可以超常数十几倍。在施行小鼠、兔子和金黄地鼠超数排卵研究中，曾有1只KM小鼠取得胚胎83枚，有1只免取得胚胎88枚，有1只金黄地鼠采得72枚胚胎的记录。超排所用激素主要有三类。超排所用激素主要有三类。u第一类是FSH（促卵泡激素）及其类似物，u第二类是LH（促黄体激素）及其类似物，u第三类是外源性促排卵类激素如GnRH 等类似物，以及这些激素的复合制剂。超数排卵的意义超数排卵的意义u 采用超数排卵可大大增加每次的排卵数量。u在科研上可以在短时间内取得大量的卵和胚胎，可以满足胚胎工程研究、遗传工程研究和建立胚胎库的需要。大大缩短了研究周期。u在生产中，可以提高优秀动物的繁殖数量，提高产量，增加经济效益。3.同期发情 利用外源激素制剂或其它生物学手段人利用外源激素制剂或其它生物学手段人为地控制并调整一群雌性动物发情周期为地控制并调整一群雌性动物发情周期的进程，使之在预定的时间内集中发情，的进程，使之在预定的时间内集中发情，以便有计划地合理地组织配种，称为同以便有计划地合理地组织配种，称为同期发情或同步发情。期发情或同步发情。方法方法缩短黄体期的前列腺素法缩短黄体期的前列腺素法(PG(PG法法)延长黄体期的孕酮法延长黄体期的孕酮法 通过缩短和延长黄体期进行同期发情通过缩短和延长黄体期进行同期发情缩短黄体期缩短黄体期缩短黄体期缩短黄体期（PGFPGF22）延长黄体期延长黄体期延长黄体期延长黄体期（孕激素）（孕激素）（孕激素）（孕激素）正常发情周期正常正常发情周期正常正常发情周期正常正常发情周期正常黄体期和卵泡期黄体期和卵泡期黄体期和卵泡期黄体期和卵泡期大动物如山羊绵羊等动物主要采用前列腺素类的激素如用15-甲基PGF2或氯前列烯醇等激素使黄体溶解来达到同期发情的目的。小型啮齿类动物如小鼠可通过挑选发情母鼠与结扎公鼠交配，来达到同期发情的目的，称为假孕母鼠.动物的同期发情定义定义定义定义：利用冲冼液将胚胎从生殖道内冲出，并收集在利用冲冼液将胚胎从生殖道内冲出，并收集在利用冲冼液将胚胎从生殖道内冲出，并收集在利用冲冼液将胚胎从生殖道内冲出，并收集在器皿中。器皿中。器皿中。器皿中。4.胚胎的收集胚胎的收集胚胎收集的时间胚胎收集的时间胚胎收集的时间胚胎收集的时间：一般在配种后一般在配种后一般在配种后一般在配种后38d38d，发育至，发育至，发育至，发育至4848细胞期后；牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡细胞期后；牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡细胞期后；牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡细胞期后；牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植。早期进行收集和移植。早期进行收集和移植。早期进行收集和移植。胚胎冲洗液胚胎冲洗液:冲胚液现多用杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）、合成输卵管液（SOF）、布林斯特液等。冲胚液可加1-5牛血清白蛋白，也可不加；培养液需加入0.1-3.2的牛血清白蛋白，或用1-50犊牛血清代替（用前5630min灭活）胚胎收集方法胚胎收集方法:u手术法 u输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 u子宫角冲胚子宫角冲胚 u非手术法 二通管二通管 三通管三通管5.胚胎的检查与鉴定 胚胎的检查是指在体视镜下从冲卵液回收胚胎。同时检查胚胎的数量和质量。对发育正常的胚胎供移植或体外培养和保存。胚胎的检查项目：胚胎的检查项目：1 1、受精卵整体的形态和体积大小；、受精卵整体的形态和体积大小；2 2、透明带形状，厚度及损伤程度；、透明带形状，厚度及损伤程度；3 3、发育正常胚胎的卵裂球应该具有整齐的、发育正常胚胎的卵裂球应该具有整齐的外形，大小一致，分布均匀而紧密，发育速外形，大小一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚龄一致；度与胚龄一致；4 4、卵细胞表面颗粒的状态和多少等。、卵细胞表面颗粒的状态和多少等。1 1（）级：（）级：优秀。胚胎细胞团呈均匀对称的球形，单个卵裂球（或细胞）的大小、颜色、密度一致，胚胎的发育阶段与预期的发育阶段一致。不规则的细胞相对较少。至少有85%的细胞物质是完整的、具有活性的胚胎细胞团。这些判断是以在卵周隙中突出细胞与正常胚胎细胞的百分比为基础的。透明带必须是光滑的而不应是凹陷的或平坦的，否则会使胚胎黏附于培养皿或细管上。2 2（）级：（）级：良好。胚胎细胞团的大小和形状以及单个细胞的颜色和密度存在一定的不规则。至少有50%的细胞结构是完好的、具活性的胚胎细胞团。3 3（）级：（）级：质差。胚胎细胞团的大小和形状以及单个细胞的颜色和密度存在严重的不规则。至少有25%的细胞结构是完好的、具有活性的胚胎细胞团。4 4（）级：（）级：死亡或退化。退化的胚胎、卵母细胞或1细胞胚胎，没有活力。胚胎质量分级评定胚胎质量分级评定标准标准6.胚胎的移植胚胎的移植 胚胎的移植也有手术法和非手术法两种胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及鹿等大小动物。而非手术法仅适用于牛、马及鹿等大动物动物 。传统的胚胎移植主要由以下一些步骤组成：1.超数排卵 2.同期发情 3.胚胎收集和预处理 4.胚胎移植以小鼠为例：1.结扎公鼠的制备 为了获得同步发情的假孕母鼠，要准备结扎公鼠，通常选用5周龄公鼠做手术，分笼饲养，每笼一只。术后23周即完全康复，可用其生产假孕母鼠。目的：为了产生同期发情的母鼠2.超数排卵 腹腔注射PMSG 10U，一般选择在中午注射，间隔48小时后注射HCG，光照周期保持1214h，将注射HCG后的母鼠与正常公鼠合笼，并于第二天早上检查阴道栓，如果见栓说明已经配上种了，计做怀孕0天。受体母鼠(普通发情母鼠)与结扎公鼠合笼，第二天早上检查阴道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植。3.同期发情计算时间4.胚胎收集和预处理（1）受精卵的收集和处理见栓当日的胚胎处于1细胞期。以脱颈椎法杀死母鼠，暴露子宫、输卵管；剪下子宫、输卵管，并置于平皿中；在灭菌平皿中剪下输卵管置入盛有冲卵液的集卵杯中，在体视显微镜下撕开壶腹部，