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1、第八章第八章 发酵产物的分离提取发酵产物的分离提取第一节第一节 发酵产物分离的特点与过程设计发酵产物分离的特点与过程设计一、发酵液的一般特性一、发酵液的一般特性（1）发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。）发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。（2）成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、其他代）成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、其他代谢副产物、残留培养基、无机盐等。谢副产物、残留培养基、无机盐等。（3）含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质。）含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质。（4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、机械力等
2、敏感，不适宜条件下易失活或分解。机械力等敏感，不适宜条件下易失活或分解。提取和精制提取和精制提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度的、符合质量提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度的、符合质量标淮要求的发酵成品。标淮要求的发酵成品。发酵产物存在形式不同，用途各异，产品质量要求不同，发酵产物存在形式不同，用途各异，产品质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。分离纯化步骤有所不同。但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处理和菌体分离、但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处理和菌体分离、提取、精制、成品加工。提取、精制、成品加工。二、常用的分离技术及机制二、常用的分离技术及机制p267发酵产品后处理过程流程图发酵
3、产品后处理过程流程图 三三、发酵产物分离的过程选择、发酵产物分离的过程选择细胞破碎机理图细胞破碎机理图第二节第二节 细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。释放到液相中。细胞破碎的阻力细胞破碎的阻力细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越结构越致密，破碎的难度越大；大；酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧酵母细胞壁破碎的阻
4、力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的密程度和它的厚度；厚度；霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构；结构；成熟的植物细胞壁分为初生壁和成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁。次生壁。破碎方式破碎方式机械法机械法非机械法非机械法液体剪液体剪切作用切作用固体剪固体剪切作用切作用干燥干燥处理处理溶胞溶胞作用作用珠磨法珠磨法压榨压榨高压高压匀浆匀浆超声超声破碎破碎酶溶法酶溶法化学法化学法物理法物理法图图8.2 细胞破碎方法分类细胞破碎方法分类细胞的破影响因素细胞的破影响因素物理破碎时影响因素：物理破碎时影响因素：细胞的大小细胞的大小 形状形状 细胞壁的厚度细胞
5、壁的厚度 聚合物的交联程度聚合物的交联程度酶法和化学法溶解细胞影响因素：酶法和化学法溶解细胞影响因素：组成组成 结构结构高压高压匀浆匀浆法法(High-pressure homogenization)大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法原理原理：细胞：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压一
6、系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。的变化，从而造成细胞破碎。高压匀浆器高压匀浆器均质头的结构均质头的结构均质头的结构均质头的结构n大多数均质机上配备双级均质阀，在第一级中，料液大多数均质机上配备双级均质阀，在第一级中，料液压力为压力为19.6-25.4MPa,主要使脂肪球破碎，第二级料主要使脂肪球破碎，第二级料液压力减为液压力减为3.43MPa,主要使脂肪球均匀分散。阀和阀主要使脂肪球均匀分散。阀和阀座采用耐磨合金钢座采用耐磨合金钢制造。三制造。三柱塞泵的特点是排液量比柱塞泵的特点是排液量比较均匀。较均匀。传动采用二级变速，利用曲臂镶入一对人字齿轮，实传
7、动采用二级变速，利用曲臂镶入一对人字齿轮，实施对称传动，具有结构紧凑，弯矩小，受力均匀，平施对称传动，具有结构紧凑，弯矩小，受力均匀，平稳、低噪声等。稳、低噪声等。三柱塞泵三柱塞泵 往复泵往复泵 压力压力(工业生产中常用工业生产中常用5570MPa的压力的压力)循环操作次数循环操作次数(多次循环多次循环的操作方法的操作方法)温度温度高压匀浆法中影响细胞破碎的因素高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:不宜采用高压匀浆法的微生物：不宜采用高压匀浆法的微生物：易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀含有包
8、含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）浆阀）适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产留在破碎室内，浆液流出从而实现
9、连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。珠珠磨法（磨法（Bead mill）工作工作原理：原理：原理：原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套带走。带走。球磨机球磨机影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素b.珠体的装量珠体的装量na.珠体的大小珠体的大小nc.搅拌速度搅拌速度nd.操作温度操作温度ne.被处理细胞的特
10、性被处理细胞的特性 实验室规模，珠径实验室规模，珠径0.2mm，工业规，工业规模珠径大于模珠径大于0.4mm8090适当适当540珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80以下以下n其原理其原理可能与可能与空穴现象空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。引起的冲击波和剪切作用有关。超声破碎法超声破碎法（Ultra-sonication）n超生波破碎细胞时的频率一般为超生波破碎细胞时的频率一般为1520 kHz，功率，功率为为100250W，可分为，可分为槽式槽式和探头直接插入介质式和探头直接插入介质式两种型式。两种型式。影响超生波破碎的因素影响超生波破碎的因素声强、声强、频率、频率、破碎
11、时间、破碎时间、介质的离子强度、介质的离子强度、pH菌体的浓度和种类。菌体的浓度和种类。n一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比细菌比G+细菌易破碎，对酵母细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20左右左右。此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利形成冰晶体，利用用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎而破碎。该法主要用于实验室，具有
12、使用范围广、破碎。该法主要用于实验室，具有使用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。不率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。不适用于对冷冻敏感的物质。适用于对冷冻敏感的物质。X-press法法渗透压渗透压冲击法（冲击法（Osmotic pressure）反复冻融法反复冻融法干燥法干燥法酶溶法酶溶法化学试剂破碎法化学试剂破碎法外加酶法外加酶法自溶法自溶法表面活性物质表面活性物质EDTA螯合剂螯合剂有机溶剂有机溶剂变性剂变性剂2.化学破碎化学破碎（Chemical permeation）（1）酶溶法）酶溶法（Enzymatic Lysis）外加酶法外加酶法常常用用的的溶
13、溶酶酶G+溶菌酶、适量抑制剂溶菌酶、适量抑制剂G-溶菌酶、溶菌酶、EDTA放线菌放线菌 溶菌酶溶菌酶酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶霉菌霉菌 几丁质酶、几丁质酶、植物植物 纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶细胞壁溶解酶是几种酶的复合物细胞壁溶解酶是几种酶的复合物选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。形完整。溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用
14、，葡聚糖抑制葡聚糖酶。抑制葡聚糖酶。酶溶法的优点：酶溶法的优点：酶溶法的缺点：酶溶法的缺点：某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。来。（2）化学试剂破碎法）化学试剂破碎法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。组成。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的用碱处理细胞，可
15、以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。离的氨基酸。如如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温吐温等也可使细胞破碎。等也可使细胞破碎。表面活性剂表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破可促使
16、细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。碎。处理处理G-细菌，细菌，对细胞外层膜有破坏作用。对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或或Mg2+结合脂多糖和蛋白结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦质来维持，一旦EDTA将将Ca2+或或Mg2+螯合，大量的脂多螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。EDTA螯合剂螯合剂能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。有机溶剂有机溶剂变性剂变性剂盐酸胍盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲和脲（Urea）是常）是常用的变性剂。用的变性剂。常用的有机溶剂：常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。及高级醇等。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于
