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1、三级学科微生物学及检验项目编号码 _ 项目导师制实验报告实验名称:肠道菌群分离培养、鉴定及药敏分析学生姓名:曾正勇年级:2013医检 1 班专业:医学检验学指导教师:王健教授实验日期:2015年 11 月 4 日安徽理工大学医学院二 O 一五 年 十一 月名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 23 页 -一、实验概述细菌:广义的细菌即为原核生物。是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区（nuclear region)（或拟核）的裸露DNA 的原始单细胞生物，包括真细菌（eubacteria）和古生菌（archaea）两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌
2、为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。肠道菌群是 肠道菌群，人体肠道的正常微生物，如双歧杆菌，乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素，如B 族维生素（维生素B1、B2、B6、B12），维生素 K，烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，如天冬门氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。这些营养物质对人类的健康有着重要作用，一旦缺少会引起多种疾病。人体肠道内寄生着10 万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感
3、染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应.根据可培养细菌的数量分类在肠道菌群中，可以培养到的细菌有400 余种，依据其数量多少可以分为主要(优势)菌群(predominant mieroflora)和次要菌群(sub dominant microflora)。主要(优势)菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在1010cfu/g 以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。次要菌群：数量在 1010cfu/g 以下
4、，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。乳杆菌在数量上归为次要菌群，在回肠中含量较高，但是其具有较为重要的功能，因此在功能上归属于优势菌群。优势菌群与微生境的特征密切相关，以厌氧菌为主的优势菌群，一般生存在清除速率较低、营养丰富的微生境，如结肠，所以菌群密集度和多样性高；而兼性或需氧菌群一般生活在清除速率高的微生境，如小肠近端，其菌群密集度和菌群多样性较低，由于菌群密集度低，很难称得上是“优势菌群”；在酸性微生境中，耐酸、产酸的细菌成为优势菌群。微生境的改变，可使菌群中的优势菌群发生替换，如便秘时大便优势菌群主要是革兰阴性厌氧菌，
5、慢性腹泻时常见革兰阳性杆菌为优势菌群，而在严重急性腹泻时大便中的优势菌群为致病性细菌或某些兼性/需氧细菌。在肠道中，尽管专性厌氧菌是主要菌群，占据优势，但这些菌群又依赖于需氧菌或兼性厌氧菌等次要菌群的存在，因为后者在增殖过程中消耗氧气，保证前者的生长条件。一个生理性组合的肠道菌群是有益的，而病理性组合的肠道菌群是有害的。人体肠道内的微生物中，超过99%都是细菌，存活着数量大约有100 兆个，有 5001000 个不同的种类。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类：有益菌、有害菌和中性菌。有益菌，也称之为益生菌，主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌等，是人体健康不可缺少的要素，名师资料总结-精品资料欢迎
6、下载-名师精心整理-第 2 页，共 23 页 -可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等。有害菌，数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质，或者影响免疫系统的功能。中性菌，即具有双重作用的细菌，如大肠杆菌、肠球菌等，在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控，或从肠道转移到身体其他部位，就可能引发许多问题。人体的健康与肠道内的益生菌群结构息息相关。肠道菌群在长期的进化过程中，通过个体的适应和自然选择，菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因此，人体在正常
7、情况下，菌群结构相对稳定，对宿主表现为不致病。有研究指出，体魄强健的人肠道内有益菌的比例达到70%，普通人则是25%，便秘人群减少到15%，而癌症病人肠道内的益生菌的比例只有10%。药敏试验是指 体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验（AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。目前，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test 法），和自动化仪器等。本实验以在校医学生粪便标本为样品，探讨肠道菌群的分离、培养、鉴定和药敏，了解在校医学生肠道菌群分布状况及对常用抗生素的敏感性，为预防肠道细菌感染和合理使用抗生素提供实验依据。
8、名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 23 页 -二、实验目的和意义1、掌握培养基的配制方法培养基的配置过程主要包括：调配、溶化、校正pH 值、澄清过滤、分装、灭菌及检定和保存。调配：溶化：校正pH 值：澄清过滤：分装：灭菌：鉴定：保存：2、熟悉湿热灭菌的原理和应用湿热灭菌一般采用高压蒸汽灭菌，在 103.4KPa 蒸汽压下，温度能达到121.3维持 1520 分钟，就能杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物，是一种彻底的灭菌方法。3、掌握肠道标本的采集方法标本的收集、存放与运送的得当与否，直接关系到检验结果的准确性。应采取新鲜粪便，盛于洁净、干燥无吸水性的有盖容器内，不得混
9、有尿液、水或其他物质，以免破坏有形成分，使病原菌死亡和污染腐生性原虫、真菌孢子、植物种子、花粉易混淆检验结果。采集标本时应用干净竹签选取含有粘液、脓血等病变成分的粪便；外观无异常的粪便须从表面、深处及粪端多处取材，其量至少为大拇指末段大小（约5g）。标本采集后一般情况应于1h 内检查完毕，否则可因p H 及消化酶等影响导致有形成分破坏分解。4、掌握肠道正常菌群、肠道致病菌和肠道条件致病菌肠道正常菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，对人体有益无害并与人体保持平衡。肠道致病菌：除大肠正常菌群之外可导致疾病发生的菌种，主要是沙门氏菌、志贺氏菌变形杆菌、大肠埃希菌耶尔森菌；肠道条件致病菌：与
10、人体共同生活，以兼性厌氧菌为主是肠道非优势菌群，如肠球菌，肠杆菌，在肠道微生态平衡时，对人体无害，但在特定条件下会具有一定的致病性。5、掌握肠道菌群在肠道选择培养基上的生长特点肠道菌群在选择性培养基上生长特点：肠道菌群需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑湿润，液体培养基混浊生长。6、掌握肠道菌群的生化反应肠道菌群生化反应活泼。乳糖发酵试验：肠道非致病菌+，肠道致病菌-（除外变形杆菌）。肠杆菌科定科试验主要项目是革兰阴性杆菌、触酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阳性。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 23 页 -7、掌握肠道菌群的鉴定要点鉴定肠道菌群首先要保证粪便的
11、新鲜且没有受到污染，掌握菌落的基本形态特征，要熟悉各种菌落的生化反应的特点。8、掌握细菌的药敏试验体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验（AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好的掌握药物对细菌的敏感度，所以一个正确的结果，可供临床医师选用抗菌药物的参考，并提高疗效三、实验应具备的物质条件1、试剂：革兰染液，触酶及氧化酶试剂
12、，蒸馏水等。培养基：ss 培养基，麦康凯培养基，普通培养基，半固体培养基，克氏双糖铁培养基系统生化管：J2026 纤维二糖杭州微生物试剂有限公司批号 20071109 J2019 木糖杭州微生物试剂有限公司批号 20080108 J2018 阿拉伯糖杭州微生物试剂有限公司批号 20080527 J2044 七叶苷杭州微生物试剂有限公司批号 20080102 J2016 甘露醇生化管杭州微生物试剂有限公司批号 20070914 -半乳糖苷（OPNG）杭州微生物试剂有限公司批号 20090422 麦芽糖杭州微生物试剂有限公司批号20090331 枸橼酸盐生化管杭州微生物试剂有限公司批号200904
13、09 赖氨酸脱羧酶生化管杭州微生物试剂有限公司批号20090325 尿素生化管杭州微生物试剂有限公司批号20090317 精氨酸脱羧酶生化管杭州微生物试剂有限公司批号20090105 鸟氨酸脱羧酶生化管杭州微生物试剂有限公司批号20090219 药敏纸片：氯霉素（30ug/片）杭州微生物试剂有限公司批号20150305 庆大霉素（10ug/片）杭州微生物试剂有限公司批号20150202 环丙沙星（30ug/片）杭州微生物试剂有限公司批号20150210 红霉素（15ug/片）杭州微生物试剂有限公司批号20150106 名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 23 页 -青
14、霉素（10ug/片）杭州微生物试剂有限公司批号20150209 2、仪器：恒温培养箱，干烤箱，高压灭菌锅，半自动生化分析仪，水平离心机，显微镜等3、其他：接种环，酒精灯，火柴，试管架，记号笔，载玻片四、注意事项1 天平的使用：称量前要注意天平的调平，应先把游码归零，放上称量纸后在调平天平，称量时务必做到“左物右码”称量后把天平放回原处。2 在配置半固体（动力）培养基和克氏双糖铁培养基时，按参加实验的人数配适量的培养液，并注意各种试剂之间和水的比例。3 在配置培养基时注意培养基的pH 纸（一般肠道细菌的最适pH 值为 7.27.6，配置的培养基的pH值应为 7.47.6）。4 用手提式压力蒸汽灭
15、菌器灭菌，在灭菌前应核对排气阀是否处以开的状态，而安全阀应处于关闭的状态。5 制备克氏双糖铁斜面培养基时，从高压灭菌锅中取出趁热放置成高层斜面，放置过程中禁止试管滚动，待凝固后放入冰箱保存，作无菌试验备用。6 高压蒸汽灭绝菌锅的使用原则严格按照高压蒸汽灭绝菌锅的使用原则使用，使用前务必检查高压蒸汽灭绝菌锅中的水是否符合加热的要求，通电前检查排气阀是否开启，安全阀是否关闭，待冷气排尽关上排气阀安全阀开始喷漆时开始计时，等指针回到原位时才能打开盖子，注意切断电源。7 取粪便细菌标本：要取新鲜的粪便（不能超过2 小时）份量在1 克左右，严禁粪尿混合，正常标本取表面，异常标本取粘液或脓血部分。8 可疑
16、菌落的鉴别：在SS培养基上如果出现可疑菌落如黑色菌落，应要鉴定其种属。9 生化反应的判断和分析：在做生化鉴定时应注意生化管前后对照，以便判断实验结果。10 药敏试验分析：在做药敏实验时，采用密集画线发，要尽量画的密，画的均匀，使之呈均匀分布，放药敏纸片要注意各个纸片之间的距离和培养皿壁的距离。测量结果是要多次测量取其平均值。五、实验设计原理1、采用分离划线法分离培养肠道细菌名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 23 页 -平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细菌用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细菌，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。用于目的微生物的分离，便于得到目的性状的单克隆。2、采用初步生化反应和系统生化反应鉴定肠道致病菌和肠道条件致病菌初步生化反应和系统生化反应鉴定肠道菌群是借助各种肠道细菌具有的各自酶系统对底物的分解能力及其代谢产物的不同来进行的。而这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。初步生化反应时，根据革兰染色阴性
