《PCR技术在乙肝方面的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR技术在乙肝方面的应用（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PCR技术在乙肝方面的应用技术在乙肝方面的应用The application of PCR technique in HBVThe application of PCR technique in HBV 涿州市医院检验科 刘鹏年第一页，共五十五页。Hepatitis B Virus乙型肝炎的病原体乙型肝炎的病原体在全世界广泛流行，估计全球半数以上人在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被口已被HBVHBV感染过。感染过。中国：乙肝高发区，人群中国：乙肝高发区，人群HBsAgHBsAg的检出率的检出率达达9.8%9.8%第二页，共五十五页。乙型肝炎病毒感染的现状乙型肝炎病毒感染的现状全球约有3
2、.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能开展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。第三页，共五十五页。第四页，共五十五页。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae，基因组长度3.2kb 目前感染人类最小的DNA病毒 局部双链环状DNA。第五页，共五十五页。HBV基基 因因 及及 编编 码码 蛋蛋 白白第六页，共五十五页。H
3、epatitis B Virus第七页，共五十五页。第八页，共五十五页。乙肝的实验室诊断乙肝的实验室诊断一生化学检查一生化学检查二二HBV血清学检查血清学检查三三HBVDNA、基因型和变异检查、基因型和变异检查第九页，共五十五页。生化学检查生化学检查ALTALT和和ASTAST血清胆红素血清胆红素凝血酶原时间凝血酶原时间PTPT及及PTAPTA胆碱酯酶胆碱酯酶血清白蛋白血清白蛋白甲胎蛋白甲胎蛋白AFPAFP第十页，共五十五页。生化检测的局限性生化检测的局限性敏感度有限敏感度有限代表肝细胞损害，水平上下不能代表肝储代表肝细胞损害，水平上下不能代表肝储藏能力藏能力关于关于“胆酶别离现象胆酶别离现象
4、第十一页，共五十五页。HBV血清学检查血清学检查工程：工程：HBsAg、抗、抗-HBs、HBeAg、抗、抗-HBe、抗、抗-HBc以及抗以及抗-HBcIgM方法方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性，最常用，定性)发光免疫分析发光免疫分析(定量定量)第十二页，共五十五页。HBsAg 感染的标志感染的标志Anti-HBs 既往感染既往感染/接种疫苗接种疫苗 Anti-HBc IgM Anti-HBc IgM 急性感染标志急性感染标志急性感染标志急性感染标志Anti-HBc IgG 既往或慢性感染既往或慢性感染 HBeAg HBeAg 急性病毒
5、复制，有传染性急性病毒复制，有传染性急性病毒复制，有传染性急性病毒复制，有传染性 Anti-HBe 病毒不再复制病毒不再复制HBV-DNA 急急性性病病毒毒复复制制，比比HBeAg更更准准确确；主要用于监测治疗反响主要用于监测治疗反响第十三页，共五十五页。血清学检测的临床意义HBsAgHBsAg抗抗抗抗-HBsHBeAg-HBsHBeAg抗抗抗抗-HBe-HBe抗抗抗抗-HBc-HBc临床意义临床意义临床意义临床意义 急性或慢性感染急性或慢性感染(大三阳大三阳)+-+-+乙肝后期或慢性感染乙肝后期或慢性感染(小三阳小三阳)-+-潜伏期或急性乙肝早期潜伏期或急性乙肝早期-+痊愈或恢复期痊愈或恢复
6、期,有免疫力有免疫力-+-痊愈痊愈,有免疫力有免疫力疫苗接种或曾经感染过疫苗接种或曾经感染过,有免疫力有免疫力第十四页，共五十五页。血清学检测的局限性血清学检测的局限性HBV具有具有“检测窗口期检测窗口期假阴性结果假阴性结果无法检测突变株及抗体无法检测突变株及抗体第十五页，共五十五页。SymptomsHBeAganti-HBeIgG anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100Acute HBV Infection with RecoveryTypical Serologic CourseWeeksafterExposureTi
7、tre第十六页，共五十五页。IgM anti-HBcIgG anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216 20 2428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgression to Chronic HBV InfectionTypical Serologic Course第十七页，共五十五页。第十八页，共五十五页。PCR技术检测HBV DNAPCRPCR聚合酶链式反响于聚合酶链式反响于聚合酶链式反响于聚合酶链式反响于19831983年由美国年由美国年由美国年由美国CetusCet
8、us公司的公司的公司的公司的K.MullisK.Mullis建立，并和定建立，并和定建立，并和定建立，并和定点突变的创造者点突变的创造者点突变的创造者点突变的创造者M.SmithM.Smith一起荣获一起荣获一起荣获一起荣获19931993年度诺贝尔化学奖，为生年度诺贝尔化学奖，为生年度诺贝尔化学奖，为生年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。命科学领域的研究开创了崭新时代。命科学领域的研究开创了崭新时代。命科学领域的研究开创了崭新时代。第十九页，共五十五页。PCR概念 PCRPolymerase Chain Reaction即聚合酶链式反响，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DN
9、A为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。第二十页，共五十五页。PCR反响的特点反响的特点 特异性强特异性强特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 指数增长指数增长，从，从，从，从pg(10pg(10-12)可扩增至可扩增至可扩增至可扩增至 m mg(10g(10-6-6)水平水平水平水平 简便、
10、快速简便、快速简便、快速简便、快速 2 2小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总粗制品及总RNA均可作为扩增模板均可作为扩增模板 第二十一页，共五十五页。PCR反响过程DNA的体外复制包括的体外复制包括3个步骤：个步骤：变性变性denaturation:94C30s退火退火annealing:55C30s延伸延伸extension:72C30-60s3个步骤作为个步骤作为PCR的一个循环，每当完成的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，一个循环，一个分子的模板被复制为二个，
11、产物量以指数形式增长。产物量以指数形式增长。第二十二页，共五十五页。第二十三页，共五十五页。第二十四页，共五十五页。普通普通普通普通 PCRPCRPCRPCR 技术的缺点技术的缺点技术的缺点技术的缺点 普通普通普通普通PCRPCRPCRPCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部
12、曾在因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在1997199719971997年行文禁止将普通年行文禁止将普通年行文禁止将普通年行文禁止将普通PCRPCRPCRPCR技术用技术用技术用技术用于临床诊断。于临床诊断。于临床诊断。于临床诊断。第二十五页，共五十五页。定量定量PCR的特点的特点 采采用用闭闭管管检检测测，不不需需PCRPCR后后处处理理，并并采采用用dUTP-UNGdUTP-UNG酶酶的的防防污污染染系系统统，扩扩增增和和检检测测一一次次同同时时完完成成。不不需需开开盖盖，不不产产生污染。生污染。防止了假阳性。防止了假阳性。探针与被检探针与被检DNADNA序列特异杂交，序
13、列特异杂交，增强了特异性。增强了特异性。第二十六页，共五十五页。定量定量PCR的特点的特点可可可可定定定定量量量量结结结结果果果果，准准准准确确确确灵灵灵灵敏敏敏敏地地地地反反反反响响响响了了了了病病病病原原原原体体体体的的的的感感感感染染染染和和和和治治治治疗恢复情况。疗恢复情况。疗恢复情况。疗恢复情况。光光光光谱谱谱谱分分分分析析析析仪仪仪仪直直直直读读读读结结结结果果果果，自自自自动动动动分分分分析析析析，增增增增强强强强了了了了灵灵灵灵敏敏敏敏性性性性和客观性。和客观性。和客观性。和客观性。第二十七页，共五十五页。HBV DNA检测方法的比较 斑点杂交斑点杂交 PCR PCR 定量定量
14、PCRPCR敏敏感感性性 低低 较较高高 高高特特异异性性 高高 稍稍低低 高高重重复复性性 好好 稍稍差差 好好定定量量范范围围 4 4 6 6 6 6简简便便 较较繁繁琐琐 简简便便 简便简便平平安安性性 好好 稍稍差差 好好设设备备 廉廉价价 稍稍贵贵 昂贵昂贵技技术术要要求求 低低 高高 高高检检测测价价格格 低低 中中 高高第二十八页，共五十五页。为什么建议每个病人都要进行HBV DNA检测？第二十九页，共五十五页。HBV DNA检测的临床意义 诊断方面：诊断方面：HBV DNA HBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据 HBV DNA HBV DNA是是HBV
15、HBV复制的标志复制的标志 HBV DNA HBV DNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志第三十页，共五十五页。HBV DNA检测的临床意义 对对HBV-MHBV-M起补充作用：起补充作用：HBeAg()/HBeAg()/抗抗HBe()HBe()乙型肝炎乙型肝炎 前前C C区变异区变异 HBsAg()HBsAg()乙型肝炎乙型肝炎 S S区变异区变异 低水平感染低水平感染 单项抗单项抗HBc()HBc()乙型肝炎乙型肝炎 第三十一页，共五十五页。HBV基基 因因 及及 编编 码码 蛋蛋 白白第三十二页，共五十五页。HBV DNA检测的临床意义 疗效判断：疗效判断：HBV HBV D
16、NADNA是是目目前前判判断断乙乙肝肝抗抗病病毒毒药药物物疗效最敏感的指标疗效最敏感的指标 预后判断预后判断 HBV DNA HBV DNA水平与病情有一定的关系水平与病情有一定的关系第三十三页，共五十五页。HBV-MHBV-M与与HBV DNAHBV DNA关系关系 广东广东 四川四川 湖南湖南 解放军解放军 南方医南方医院院 “大三阳大三阳大三阳大三阳 86.2 85.0 87.3 86.2 85.0 87.3 86.2 85.0 87.3 86.2 85.0 87.3 94.38 93.494.38 93.494.38 93.494.38 93.4“小三阳小三阳 35.1 20.3 25.6 35.1 20.3 25.6 27.3 23.827.3 23.8“小二阳小二阳 40.7 27.6 48.8 40.7 27.6 48.8 38.56 30.538.56 30.5 抗抗抗抗HBc 11.5 10.8 HBc 11.5 10.8 HBc 11.5 10.8 HBc 11.5 10.8 19.319.319.319.3 抗抗HBs 3.6 0 9.7 HBs 3.6 0 9.
