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1、急性髓系白血病中骨髓微环境介导耐药的探索急性髓系白血病中骨髓微环境介导耐药的探索相关背景相关背景急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。化疗联合造血干细胞移植是AML的主要治疗手段。尽管患者预后已有极大改善，仍有部分患者复发或难药，降低了AML患者的OS及PFS。文献报道急性髓系白血病对化疗不敏感，部分原因是骨髓中的基质细胞对白血病细胞的保护作用。相关报道相关报道2013
2、年cancer letter一篇文章报道了Wnt信号通路在MSC介导的ALL细胞耐药中的作用机制，阐明此通路可作为靶向治疗靶点。该文首先报道MSC对ALL细胞增殖和凋亡中的影响。(A)与MSC共培养的ALL细胞系其凋亡率下降。(B)与MSC共培养的ALL原代细胞其凋亡率下降。Western blot结果发现与MSC共培养后细胞周期相关蛋白的表达改变。与MSC共培养后ALL细胞的wnt通路相关基因及蛋白表达改变。加入wnt抑制剂后，可促进ALL细胞的凋亡小动物活体成像实验发现加入wnt通路抑制剂及阿糖胞苷后，小鼠体内瘤体明显缩小，生存期延长。说明wnt通路抑制剂可拮抗MSC诱导的ALL细胞耐药
3、白血病微环境中的多种细胞成分对白血病细胞有保护作用，其中包括基质细胞（间充质干细胞）。为阐明机制，该文作者将急性淋巴细胞白血病细胞与骨髓基质细胞共培养，研究后者对白血病细胞基因和蛋白水平的影响。结果表明Wnt信号参与MSC介导白血病细胞耐药。阻断Wnt通路可增强白血病细胞对化疗的敏感率，改善白血病小鼠模型的存活率。Yang Yang,Saradhi Mallampati,Baohua Sun,et al.Wnt pathway contributes to the protection by bone marrow stromal cells of acute lymphoblastic le
4、ukemia cells and is a potential therapeutic target.Cancer Lett.2013 June 1;333(1):.doi:10.1016/j.canlet.2012.11.056.总结：2009年Blood一篇文章报道骨髓基质细胞可保护CLL细胞逃避药物诱导的凋亡，从而导致CLL细胞的耐药小鼠MSC与CLL细胞共培养后，可降低氟达拉滨诱导的CLL细胞凋亡同样，人MSC与CLL细胞共培养后，可降低氟达拉滨诱导的CLL细胞凋亡MSC与CLL细胞共培养后，可降低地塞米松诱导的CLL细胞凋亡当环磷酰胺与氟达拉滨联用时MSC对CLL细胞的保护作用消失W
5、estern blot结果显示CLL细胞与MSC共培养后，促细胞凋亡相关蛋白如Mcl-1和PARP的剪切体表达下降总结总结骨髓基质细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞耐药中起重要作用。该文作者将人和小鼠骨髓基质细胞系和人CLL细胞共培养，检测药物诱导的细胞凋亡的改变。研究结果表明骨髓基质细胞可保护CLL细胞免受氟达拉滨诱导细胞凋亡。骨髓基质细胞也保护CLL细胞免受地塞米松和环磷酰胺诱导的细胞凋亡。骨髓基质细胞可保持Mcl-1，并保护CLL细胞免受氟达拉滨诱导的Mcl-1和PARP裂解Antonina V.Kurtova,1 Kumudha Balakrishnan,2 Rong Chen,et
6、 al.Diverse marrow stromal cells protect CLL cells from spontaneous and drug-induced apoptosis:development of a reliable and reproducible system to assess stromal cell adhesion-mediated drug resistance.Blood.2009;114:4441-44502013年JCI一篇文章报道c-Myc/miR-548m/HDAC6通路在非霍奇金B细胞淋巴瘤的细胞耐药中起重要作用将B细胞淋巴瘤细胞系与MSC细胞
7、系HK共培养后，通过基因芯片发现miR-548m,miR-548f和miR-548h的表达下调(A)。Taqman realtime PCR结果发现B细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1,HBL-2,SUDHL-4与MSC细胞系HK共培养后，miR-548m的表达下调(B)。Western blot结果同样显示在这三种细胞系与HK共培养后，HDAC6的蛋白表达上调(C)。淋巴瘤细胞系HBL-2,SUDHL-4与另一种MSC细胞系HS-5共培养后，HDAC6的蛋白表达上调（左），miR-548m的表达下调（右）套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FCL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原代淋巴瘤
8、细胞与MSC细胞系HK共培养后，miR-548m的表达均下降套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FCL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原代淋巴瘤细胞与MSC细胞系HK共培养后，HDAC6蛋白的表达均上调通过逆转录病毒载体感染Jeko-1使之高表达miR-548m（左上），通过realtime PCR（左下）和western（右）检测HDAC6的表达，结果发现HDAC6的表达下降。反之，干扰Jeko-1细胞miR-548m的表达（左上）后，HDAC6的表达增加。荧光素酶报告载体实验证实miR-548m负向调控HDAC6HBL-2与HK共培养后，生成的集落数明显多于单独培养组。HBL-2
9、高表达miR-548m后，生存的集落数低于对照组。miR-548m+HBL-2与HK共培养后，集落数也低于对照。干扰HBL-2中HDAC6后，生存的集落数低于对照组。HDAC6 knockout-HBL-2与HK共培养后，集落数也低于对照。在单独培养组与共培养组加入环孢素A和/或米托蒽醌，检测淋巴瘤细胞的凋亡率。集落形成实验结果显示，加入环孢素A后，共培养组的集落数多于单独培养组。体内成瘤实验结果显示，将HK和HBL-2共同皮下注射组的瘤体明显大于单独注射HBL-2组HBL-2细胞高表达miR-548m后，瘤体较对照缩小。与HK共同注射后，miR-548m+组的瘤体也小于miR-548m-组m
10、iR-548m的表达与c-Myc呈负相关干扰c-Myc表达后，miR-548m的表达上调上调miR-548m表达后，c-Myc的表达下降加入c-Myc抑制剂后检测HBL-2的凋亡率总结总结淋巴瘤细胞及其微环境处于一个动态的相互作用中。使用克隆培养和裸鼠移植瘤生长系统模型，本文表明，套细胞淋巴瘤（MCL）和其他非霍奇金淋巴瘤细胞与基质细胞共培养后可产生耐药性，促进淋巴瘤细胞的克隆形成，并诱导组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的表达。此外，基质还可激发c-myc/miR-548m前馈回路，导致c-myc的持续活化，mir-548m的下调，和HDAC6的上调，从而导致淋巴瘤细胞的扩增和淋巴瘤进展。加入
11、HDAC6抑制剂和/或c-Myc抑制剂可促进淋巴瘤细胞死亡，拮抗细胞耐药，抑制淋巴瘤体外克隆形成和生长在体内。Tint Lwin,Xiaohong Zhao,Fengdong Cheng,et al.A microenvironment-mediated c-Myc/miR-548m/HDAC6 amplification loop in non-Hodgkin B cell lymphomas.The Journal of Clinical Investigation.2013;4612-4617我们的工作我们的工作AML细胞系U937,KG1a,及AML原代细胞与MSC共培养后，细胞凋亡率
12、明显下降。在单独培养的AML细胞中加入米托蒽醌后，U937，KG1a，原代AML细胞的凋亡率分别为43.5%，48.7%，71.8%。与MSC共培养后加入米托蒽醌，U937，KG1a，原代AML细胞的凋亡率明显下降。与MSC共培养后，KG1a，U937(A)及AML原代细胞(B)中c-Myc的表达升高。10058F4是c-Myc的特异性抑制剂，在AML细胞培养中加入10058F4，AML细胞c-Myc的表达明显下降(B)，AML细胞的凋亡率明显升高(A)。与MSC共培养体系中加入10058-F4，AML细胞的凋亡率高于未加10058F4组。通过siRNA干扰使AML细胞系U937中c-Myc的
13、表达下调(A)。干扰后，AML细胞的凋亡增加，加入米托蒽醌后，干扰组的凋亡率高于未干扰组(B)。通过transwell实验证实，MSC对AML细胞起作用需要两者间紧密接触。如图A所示，AML细胞与MSC共培养后其凋亡率显著下降，而transwell实验显示凋亡率无明显变化。同样，如图B所示，AML细胞与MSC共培养后c-Myc的表达升高，而transwell实验中c-Myc表达无明显改变。MSC主要通过凋亡和血管生成两种途径干扰AML细胞的生存，通过10058F4或干扰的方法使AML细胞中的c-Myc表达下降，通过western blot检测发现抗凋亡相关蛋白如Bcl2,Bcl-XL表达上调，
14、血管生成蛋白如VEGF表达上调。而促凋亡蛋白如caspase-3和PARP的剪切体表达下调。急性髓系白血病（AML）是一种对化疗不敏感的恶性血液病。AML细胞和骨髓（BM）微环境之间的相互作用在AML耐药中起着至关重要的作用。基质细胞是骨髓微环境中影响AML细胞的组成部分。我们研究的目的是阐明基质细胞对AML细胞耐药的作用基质。结果发现，AML细胞系U937，KG1a细胞和原代AML细胞与MSC共培养后，可减少药物诱导的细胞凋亡。Western结果发现共培养后AML细胞c-Myc的表达上调。加入c-Myc抑制剂10058-F4或干扰c-myc表达后，可明显促进细胞凋亡。Western blot
15、结果发现抑制c-myc基因的表达可诱导caspase-3，PARP裂解体的表达，并下调Bcl-2,Bcl-XL，VEGF的表达。因此，我们得出结论：骨髓基质细胞通过c-myc通路介导白血病细胞的耐药。因此c-myc是克服AML耐药的一个潜在的治疗靶点为阐明MSC上调AML细胞中c-Myc的机制，通过基因芯片比较了与MSC共培养前后AML的microRNA表达谱。挑选出6个与c-Myc调控相关的microRNA。通过realtime PCR验证找到miR-494和miR-17是调控c-Myc的microRNA。通过生存曲线分析，发现miR-494与AML患者的OS和PFS密切相关，定为下一步研究
16、的靶miRNA。通过荧光素酶报告载体实验证实miR-494是c-Myc的负向调控子通过逆转录病毒载体提高AML细胞中miR-494的表达。(A)感染后AML细胞中miR-494的表达上调。(B)感染后AML细胞中c-Myc的表达下调(C)Western blot检测发现感染后AML细胞中c-Myc蛋白的表达下调将感染后的AML细胞与MSC共培养，发现其OD值没有明显改变，说明过表达miR-494后可拮抗MSC引起的AML增殖改变。加入米托蒽醌后，miR-494+AML细胞的OD明显下降，说明miR-494过表达可拮抗MSC诱导的耐药体体外外实实验验证证实实miR-494活活化化可可抑抑制制化化疗疗药药物物诱诱导导的的AML细胞凋亡细胞凋亡 皮皮下下成成瘤瘤实实验验：与与基基质质细细胞胞共共同同皮皮下下注注射射的的AML细细胞胞形形成成的的肿肿瘤瘤明明显显大大于于单单独独皮皮下下注注射射AML形形成成的的肿肿瘤瘤，活活化化AML细细胞胞中中miR-494的的表表达达后后可可抑抑制制皮皮下下肿肿瘤瘤的形成的形成体体内内实实验验：活活化化AML细细胞胞中中miR-494表表达达后后与与基基质
