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1、基因组作图基因组作图 genomemapping 重庆医科大学重庆医科大学彭惠民彭惠民教授教授/博导博导研究方向：研究方向：microRNA基因调控基因调控E-mail:phm614qq 基因组学基因组学这条轨道上的信息中蕴藏多少金钱呢？基因组学领域的风险投资前景这条轨道上的信息中蕴藏多少金钱呢？基因组学领域的风险投资前景我国能在竞争中我国能在竞争中占据多少地盘呢？占据多少地盘呢？基本要求1、掌握基因组遗传图和基因组物理图的、掌握基因组遗传图和基因组物理图的概念和原理；概念和原理；2、了解基因组作图技术进展和在医学研、了解基因组作图技术进展和在医学研究中的应用。究中的应用。The Nobel
2、Prize in Physiology or Medicine 1933The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1933与基因组作图有关的诺贝尔奖与基因组作图有关的诺贝尔奖摩尔根：遗传的染色体理论摩尔根：遗传的染色体理论TheNobelPrizeinChemistry1962TheNobelPrizeinChemistry1962与基因组作图有关的诺贝尔奖与基因组作图有关的诺贝尔奖沃森和克里克：沃森和克里克：DNADNA双螺旋结构双螺旋结构The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978The Nobel
3、Prize in Physiology or Medicine 1978Arber WArber WNathans DNathans DSmith HSmith Hfor for the the discovery discovery of of restriction restriction enzymes enzymes and and their their application to problems of molecular geneticsapplication to problems of molecular genetics限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用与基因组作图有关
4、的诺贝尔奖与基因组作图有关的诺贝尔奖The Nobel Prize in Chemistry 1958/1980Sanger FSanger F桑桑格格研研究究蛋蛋白白质质的的结结构构，成成功功地地测测定定了了胰胰鸟鸟素素的的精精细细结结构构，因因而而获获得得了了19581958年年的的诺诺贝贝尔尔化化学学奖奖。6060年年代代后后他他致致力力于于RNARNA和和DNADNA结结构构研研究究，其测定其测定RNARNA和和DNADNA序列的方法，序列的方法，19801980年再度获诺贝尔奖年再度获诺贝尔奖。与基因组作图有关的诺贝尔奖与基因组作图有关的诺贝尔奖TheNobelPrizeinPhys
5、iologyorMedicineTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine 19931993Mullis FMullis Ffor for his his invention invention of of the the polymerase polymerase chain chain reaction(PCR)methodreaction(PCR)method发现发现PCR方法方法与基因组作图有关的诺贝尔奖The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009The Nobel Prize in Physiology or
6、 Medicine 2009美国人伊丽莎白美国人伊丽莎白布莱克本、卡萝尔布莱克本、卡萝尔格雷德和杰克格雷德和杰克绍斯塔克，以表彰他们绍斯塔克，以表彰他们“发发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。伊丽莎白。伊丽莎白布莱克本是卡萝尔布莱克本是卡萝尔格雷德的格雷德的导师。导师。染色体研究获诺贝尔医学奖染色体研究获诺贝尔医学奖 染色体带型与序列的差距：染色体带型与序列的差距：23条染色体条染色体-31亿碱基对亿碱基对最精确的技术也难以得到大于最精确的技术也难以得到大于750bp的序列。每一的序列。每一DNA分子只能拼接序列。分子只能拼接序列。基因组作图的概念应用界标或遗
7、传应用界标或遗传学标记对基因组学标记对基因组进行精细的划分，进行精细的划分，进而标示出进而标示出DNADNA的碱基序列或基的碱基序列或基因排列的工作。因排列的工作。主要有遗传图、主要有遗传图、物理图、序列图、物理图、序列图、基因图。基因图。人类基因组四张图谱人类基因组四张图谱遗传图物理图测序：序列图1、遗传图、遗传图(geneticmapping)概念概念 通过遗传重组所得到的基因在具体染色通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图，简称遗传体上线性排列图称为遗传连锁图，简称遗传图。图。计算连锁的遗传标志之间的重组频率，计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，
8、一般用厘摩确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM(cM，即，即减数分裂的重组频率为减数分裂的重组频率为1%)1%)来表示。来表示。一、基因组遗传图2、遗传作图的基础连锁分析是遗传作图的基础。连锁分析是遗传作图的基础。摩尔根总结了连锁和交换定律。然而一个重大发现是摩尔根总结了连锁和交换定律。然而一个重大发现是在实验工作的一名大学生在实验工作的一名大学生（Sturtevant,1913)发现的：发现的：基因间交换（去连锁）的概率与它们在染色体上的距基因间交换（去连锁）的概率与它们在染色体上的距离成正比例。因而重组频率是衡量两个基因间距离的离成正比例。因而重组频率是衡量两个基因间距离的单位。单位。少数
9、例外：重组热点区域少数例外：重组热点区域结构基因和结构基因和DNADNA多态性标记可以满足要求：多态性标记可以满足要求：限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。简单序列长度多态性简单序列长度多态性（simplesequencelengthpolymorphism,SSLP):小卫星小卫星DNADNA、微卫星、微卫星DNADNA。单核苷酸多态性单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)：人类基因组中至少有人类基因组中至少有400400万个万个SNPSNP，其中只有，其
10、中只有1010万个可以形成万个可以形成RFLP。总之：它们是可以识别的结构。总之：它们是可以识别的结构。3、遗传作图标记4、遗传作图的方法对果蝇和小鼠等物种的连锁分析，进行有计划的育对果蝇和小鼠等物种的连锁分析，进行有计划的育种实验：观察后代重组率。种实验：观察后代重组率。对不发生减数分裂的细菌的连锁分析：诱导同源片对不发生减数分裂的细菌的连锁分析：诱导同源片段交换段交换，观察子代细胞重组率。观察子代细胞重组率。接合：接合：DNADNA从一个细菌到另一个细菌。从一个细菌到另一个细菌。转导：通过噬菌体转移小片段转导：通过噬菌体转移小片段DNADNA。转化：受体菌从环境中摄取供体细胞释放的转化：受
11、体菌从环境中摄取供体细胞释放的DNADNA片段片段对人的连锁分析，只能通过家系分析完成：分析家对人的连锁分析，只能通过家系分析完成：分析家庭连续几代成员遗传标记与某基因（或某疾病）共同庭连续几代成员遗传标记与某基因（或某疾病）共同出现的频率。出现的频率。家系连锁分析（PCR-电泳）遗传标记系谱连锁分析图遗传标记系谱连锁分析图“1”“1”片段与疾病基因连锁片段与疾病基因连锁难点15、遗传图谱的用途提供基因在染色体上的坐标，为基因识别和基提供基因在染色体上的坐标，为基因识别和基因定位创造了条件。因定位创造了条件。例如，例如，60006000多个遗传标记能够把人的基因组分多个遗传标记能够把人的基因组
12、分成成60006000多个区域，连锁分析找到某一疾病基因多个区域，连锁分析找到某一疾病基因与某一标记紧密连锁的证据，可把这一基因定与某一标记紧密连锁的证据，可把这一基因定位于这一已知区域。位于这一已知区域。遗传图的分子座标也是基因组物理图绘制的基遗传图的分子座标也是基因组物理图绘制的基础。础。人人类类1号号染染色色体体连连锁锁图图例子：例子：D1S160图距连锁图基因及多态性位点的分布二、基因组物理图（physical mapping)物理图物理图更精细的图谱。更精细的图谱。物理图的构建是基因组测序的基础，有承上物理图的构建是基因组测序的基础，有承上启下的作用。启下的作用。物理图与遗传图物理图
13、与遗传图比较：基因间关比较：基因间关系更准确系更准确（啤酒酵母（啤酒酵母3号号染色体）。染色体）。物理图遗传图（一）基因组物理图作图方法限制酶切作图：根据重叠序列确定酶切片段限制酶切作图：根据重叠序列确定酶切片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离的图间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离的图谱。谱。荧光原位杂交图：将分子标记与完整染色体荧光原位杂交图：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置。杂交来确定标记的位置。序列标记位点（序列标记位点（STS）图：通过对基因组片）图：通过对基因组片段进行段进行PCR和杂交分析，来对短序列进行定位和杂交分析，来对短序列进行定位作图。作图。难点2有什么方法
14、知道酶切片段之间的关系呢？答案是：有什么方法知道酶切片段之间的关系呢？答案是：重叠片段。重叠片段。重叠群：重叠群：相互间存在重叠序列的一组克隆，可相互间存在重叠序列的一组克隆，可根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接，根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接，构成连续顺序图。构成连续顺序图。以连续的以连续的重叠群重叠群为基本框架，通过遗传标记将为基本框架，通过遗传标记将重叠群排列于染色体上。重叠群排列于染色体上。物理图作图方法：限制性酶切图DNADNA分子被分子被两种两种识别不同靶序列的限制性酶切识别不同靶序列的限制性酶切和控制条件的和控制条件的部分酶切片部分酶切片段。段。限制酶切作图基本方
15、法两种限制性酶切如果控制反应条件避免完全酶切发生，因仅有如果控制反应条件避免完全酶切发生，因仅有A或或B酶切，可产生部分重叠的片段。酶切，可产生部分重叠的片段。即：这个体系中既有即：这个体系中既有7kb片段，又有片段，又有8kb片段，两种片段中有片段，两种片段中有5kb是重叠的。是重叠的。难点3AB完全酶切完全酶切如右图如右图控制条件的两种限制性酶切两酶切点之间的片段为重叠的片段两酶切点之间的片段为重叠的片段AB完全降解：获得完全酶切片段的数目和大小完全降解：获得完全酶切片段的数目和大小的图谱。的图谱。部分降解：部分降解：避免所有切口断裂的完全降解发避免所有切口断裂的完全降解发生。生。部分酶解
16、产物同样进行电泳分离及自显影。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显影。比较上述二步的自显影图谱比较上述二步的自显影图谱,根据片段大小根据片段大小及彼此间的差异即可排出酶切片段在及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNADNA链上的链上的位置。位置。部分酶切法测定DNA片段位置DNA片段片段酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）重叠群）重叠群筛选阳性筛选阳性YAC酶切酶切cosmid人工染色体重叠群人工染色体重叠群阳性阳性cosmid酶切酶切质粒亚克隆质粒亚克隆随机测序随机测序计算机分析串连得大片段。计算机分析串连得大片段。限制酶切图技术路线难点4YACYAC载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体。载体。YACYAC载体必须含有以下元件：载体必须含有以下元件：端粒重复序列端粒重复序列 着丝粒着丝粒自主复制序列自主复制序列 酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）cosmid是英文是英文cossite-carryingplasmid的缩写的缩写,也称也称粘粒、柯斯载体。是人工建造的含有粘粒、柯斯载体。是人工建造的含有噬菌体噬菌体DNA的的
