Word版本下载可任意编辑】 健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖诱导的肝损伤 1.2实验方法 1.2.1造模与分组参照Lieber-DeCarli酒精饲料配方和美国杰弗逊大学医学院酒精性肝病研究中心相关饲养方案，42只大鼠随机分正常对照组（6只）;酒精液体饲料组（24只）和无酒精液体饲料组（简称对照组，12只），均单居除正常组外，分别采用特制负压式带刻度玻璃容器，每日消毒后定量饲以酒精热量占36%的Lieber-DeCarli酒精饲料和含相同热量的无酒精对照饲料第3周起，酒精液体饲料组再次随机分为酒精液体饲料组（简称模型组，12只）、酒精液体饲料加健脾活血方组（简称中药组，12只）中药组在给予酒精饲料的同时，灌胃给药0.01ml/g，1次/d，正常组、模型组和对照组按相同标准给予蒸馏水 1.2.2取材造模6周后，大鼠禁食5h，分别灌服LPS10mg/kg（间隔10min灌1只），并在灌服LPS3.5h后，分别采取门静脉血（无热源肝素抗凝管收集制备血浆）、下腔静脉血和肝组织 1.2.3观察项目和方法（1）大鼠一般状态、进食量及体质量变化2）肝组织病理变化:HE染色，光镜下观察肝组织炎症变化和脂肪变性程度。
3）血清ALT活性和肝组织TG含量:采用生化试剂盒检测4）门脉血浆TNF-α含量测定:采用ELISA试剂盒测定5）肝组织CD68蛋白表达及分布:免疫组化染色法Ⅰ抗，PBS稀释，工作浓度1∶100;Ⅱ抗，PBS稀释，工作浓度1∶2506）肝组织CD68、TLR4和TNF-α蛋白表达:Western-blotting法 1.3统计学方法使用SPSS11.0软件包开展统计学分析，计量资料用x±s表示，组间两两比较用t检验 2结果 2.1一般状态、进食量及体质量变化对照组1只大鼠在灌饲LPS时意外死亡各组大鼠进食量和热卡摄入无明显差异，排除饮食及酒精量的差异对实验结果的影响造模前后同期各组大鼠体质量无明显差异 2.2肝脏病理变化模型组大鼠视野内1/3以上的肝细胞出现脂肪变性，以肝腺泡3带为中心，其余的大部分肝细胞变性、肿胀，胞浆内充满小的空泡，即以酒精性脂肪肝病理表现为主中药组大鼠肝细胞脂肪变性程度明显减轻，脂滴数量减少此外，对照组大鼠有3只也偶见有散在小泡状脂肪滴 2.3肝脏TG含量变化模型组肝TG含量为正常组的9.4倍和对照组的4.9倍健脾活血方可以明显降低肝组织TG含量，中药组TG含量均值为模型组的67%。
见表1 2.4门静脉血浆TNF-α含量和血清ALT活性的变化模型组门静脉血浆TNF-α含量和血清ALT活性明显高于正常组和对照组而中药组的上述指标均明显低于模型组 2.5肝脏库普弗细胞活化状态CD68免疫组化染色显示，正常组和对照组大鼠肝脏肝小叶汇管区肝窦内可见极少量CD68阳性染色模型组大鼠肝脏可见明显的CD68阳性染色区域，集中在肝细胞脂肪变性及炎细胞浸润明显的汇管区肝窦内中药组大鼠CD68阳性染色较模型组明显减少，但分布同模型组 2.6肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表达的变化正常组大鼠肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白均有少量表达，对照组TNF-α蛋白表达也略有增加，模型组大鼠肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表达则均明显增加，而中药组的上述蛋白表达均明显低于酒精模型组 3讨论 近年来，由于“二次攻击”学说被不断深入广泛地研究，酒精性肝病的发病机制研究取得了较大进展LPS是革兰阴性菌细胞膜的主要脂质成分，可以激动强烈的炎症反应大量研究说明，LPS通过活化库普弗细胞（即肝巨噬细胞）产生炎症因子参与了酒精性肝损伤的病理过程，库普弗细胞源性的TNF-α在实验性酒精性肝病中发挥了重要的病理作用［4］。
嗜酒者空肠微生物系中，革兰阴性菌含量明显增高［5］长期饲喂酒精的大鼠，用抗生素对其开展肠内灭菌或饲以乳酸菌，可降低酒精饲喂大鼠内毒素水平和肝损伤的程度，防止转氨酶的升高［6］LPS体内主要来源于肠道革兰阴性杆菌长期的酒精作用可致使肠道通透性发生改变引起肠渗漏［7］，从而使肠道内的内毒素进入血液 LPS信号的传递依赖于LPS受体的存在与活化已经证实TLR4是革兰阴性菌LPS特异性受体［8］TLR4基因突变的C3H/HeJ小鼠经4周胃内酒精灌注后，肝组织损伤程度、转氨酶水平、TNF-αmRNA表达水平均较野生型对照组明显减轻［9］LPS同血液中的LPS结合蛋白（LPSbindingprotein，LBP）形成复合物与效应细胞膜上的膜型CD14相结合，在低浓度下激活效应细胞（如单核/巨噬细胞，库普弗细胞等）［8］由于CD14缺乏跨膜功能区，LPS-LBP复合物与库普弗细胞表面的CD14结合后，在模式识别受体TLR4的参与下完成信号转导TLR4下游信号通过胞内一系列受体相关信号分子的参与最终诱导I-κB发生磷酸化降解，使NF-κB转位进入细胞核启动炎症因子如TNF-α的转录，从而导致肝损伤。
中医对于酒精性肝病有“伤酒”、“胁痛”、“酒癖”、“酒疸”和“酒臌#39;等病名，认为饮酒为外因，而素体禀赋缺陷、脾胃虚弱为内因，健脾等调理脾胃运化功能的治疗方法是临床治疗酒精性肝病的基本治法治则 我们根据中医根底理论及长期的临床实践总结了治疗酒精性肝病的有效方剂健脾活血方，并经前期的动物实验已经证实该方具有抗酒精性肝损伤的药理作用本研究重点观察了健脾活血方对Lieber-Decar-li酒精饮料诱导的大鼠酒精性肝损伤复合LPS灌胃二次攻击模型中LPS诱导库普弗细胞活化信号通路的影响大鼠肝脏组织病理学、血清ALT水平的观察结果提示，该方能够有效地抑制Lieber-Decarli酒精饮料复合LPS灌胃二次攻击所致的肝损伤同时，门脉血浆TNF-α含量、肝组织TNF-α蛋白表达检测结果均提示该方能够显著降低造模后大鼠体内TNF-α的表达，即健脾活血方能够抑制该模型中炎症因子TNF-α的释放进一步观察LPS活化库普弗细胞信号通路的上游P-IκB及LPS受体表达情况发现，经健脾活血方干预后，大鼠肝脏P-IκB和TLR4的蛋白表达明显较模型组减轻 同时，免疫组化与Western-blotting检测的结果也说明作为库普弗细胞表面标志分子的CD68蛋白表达在该方干预后明显较模型组减轻，即健脾活血方能够抑制该模型大鼠肝脏库普弗细胞的活化。
本研究的结果提示，健脾活血方具有抑制Lieber-Decarli酒精饮料复合LPS灌胃二次攻击所致的肝损伤及炎症因子TNF-α释放的药理作用同时，该方对肝脏库普弗细胞活化及LPS受体TLR4蛋白表达也具有明显的抑制作用 5 / 5。