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1、 4.7 4.7 维生素的测定维生素的测定 l概述概述l脂溶性维生素脂溶性维生素A A、E E的测定的测定l水溶性维生素水溶性维生素 B B、C C的测定的测定4.7.1 4.7.1 概述概述（1 1）维生素的分类及生理功能）维生素的分类及生理功能（2 2）测定的目的和意义）测定的目的和意义（3 3）维生素的测定方法）维生素的测定方法（1 1）维生素的分类及生理功能）维生素的分类及生理功能功能功能：维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类小分子有维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物，结构复杂，种类多。目前已经确认的有机化合物，结构复杂，种类多。目前已经确认的有3030多多种
2、，其中有种，其中有2020种被认为与维持人体健康和促进生长发育种被认为与维持人体健康和促进生长发育是至关重要的。是至关重要的。主要是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，人体对它的主要是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，人体对它的需要量极少，但作用非常大。需要量极少，但作用非常大。一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必须一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相关新陈代谢的紊乱，出现各种特有的症状。相关新陈代谢的紊乱，出现各种特有的症状。分类：分类：按溶解性能可将它们分成两大类：按溶解性能可
3、将它们分成两大类：l一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的，叫脂溶性一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的，叫脂溶性维生素（如维生素（如A A、D D、E E、K K等）；等）；l另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如B B1 1、B B2 2、B B6 6、C C、B B1212等）。等）。（2 2）测定的目的和意义）测定的目的和意义 可评价食品的营养价值；可评价食品的营养价值；开发利用富含维生素的食品；开发利用富含维生素的食品；多数维生素的性质不稳定，常常作为强化剂在食品多数维生素的性质不稳定，常常作为强化剂在食品工业的某些产品中使用。可以研究食品在不同的
4、加工业的某些产品中使用。可以研究食品在不同的加工、储存条件下的稳定性，进而指导人们制定合理工、储存条件下的稳定性，进而指导人们制定合理的工艺条件，减少维生素的损失；的工艺条件，减少维生素的损失；起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒。维生素而引起中毒。（3 3）维生素的测定方法）维生素的测定方法微生物法：微生物法：基于某种微生物生长需要特定的维生素，基于某种微生物生长需要特定的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊仪器，样品方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊仪器，样品不需经特殊处理，但只能测定水溶性维生素。不需经特殊处理，但
5、只能测定水溶性维生素。化学法：化学法：比色法、滴定法比色法、滴定法仪器法：仪器法：色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。特别色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。特别是是HPLCHPLC可用于大多数维生素的测定，并且在某些可用于大多数维生素的测定，并且在某些条件下可同时分析几种维生素，但分析费用较高。条件下可同时分析几种维生素，但分析费用较高。应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析方法应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析方法重点讲解的方法：重点讲解的方法：l高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC法）同时测定法）同时测定脂溶性维生素脂溶性维生素A A和维生素和维生素E El比色法测定维生素比
6、色法测定维生素A AlHPLCHPLC法测定胡萝卜素法测定胡萝卜素l滴定法和比色法测定维生素滴定法和比色法测定维生素C Cl荧光法测定荧光法测定 B1B1、B2B24.7.2 4.7.2 维生素维生素A A、E E的测定的测定HPLCHPLC法法 （GB/T 5009.82)GB/T 5009.82)以乳粉为样品演示样品的预处理和以乳粉为样品演示样品的预处理和HPLCHPLC的使用的使用VAVA的性质的性质：维生素维生素A A是是-紫罗酮环与一元醇所组成的一类化合物紫罗酮环与一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。通常所说的维生素及其衍生物的总称。通常所说的维生素A A是指视黄醇是指视黄醇或
7、视黄醇醋酸酯。或视黄醇醋酸酯。因有许多不饱和链，故见光易分解；因有许多不饱和链，故见光易分解；在在缺缺氧氧情情况况下下，对对热热较较稳稳定定，对对光光特特别别敏敏感感。测测定定速度要快。速度要快。不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定V VE E的性质的性质：又称生育酚，目前已经确认：又称生育酚，目前已经确认 的有的有8 8种异构体，最常见的有种异构体，最常见的有、-生育酚。生育酚。溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱性溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱性环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性环境环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性环境中也相对稳定。中也相
8、对稳定。V VE E广泛分布在各种粮食的胚和广泛分布在各种粮食的胚和植物油中。植物油中。l 测定原理：测定原理：（1 1）液相色谱的原理：）液相色谱的原理：液相色谱是采用液体为流动液相色谱是采用液体为流动相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装置等部装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装置等部分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装置导为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装置导入，随流动相在色谱柱内进行分离。分离后的组分
9、入，随流动相在色谱柱内进行分离。分离后的组分进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其他数据处理装置相连，由数据处理系统进行数据处他数据处理装置相连，由数据处理系统进行数据处理理 色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点作图。作图。l（2 2）高效液相色谱检测样）高效液相色谱检测样品中的维生素品中的维生素A A、E E的原理：的原理：样品中的维生素样品中的维生素E E及维生素及维生素A A经皂化提取处理后，将其经皂化提取处理后，将其从不皂化部分提取至有机溶从不皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法
10、剂中。用高效液相色谱法C C1818反相柱将维生反相柱将维生E E和维生素和维生素A A分离，经紫外检测器检测，分离，经紫外检测器检测，并用并用内标法内标法定量定量(3(3）什么是内标法？）什么是内标法？取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱，制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高和内标物根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高的比例为
11、纵坐标，取标准被测成分质的峰面积或峰高的比例为纵坐标，取标准被测成分量和内标物质量之比或标准被测成分量为横坐标，制量和内标物质量之比或标准被测成分量为横坐标，制成标准曲线。成标准曲线。然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样液然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样液时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，然后时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，然后按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，求出被按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之比，再按标准曲线来求出被测成分的含量。比，再按标
12、准曲线来求出被测成分的含量。内标物的选取原则：内标物的选取原则：能与被测成分完全分离，能与被测成分完全分离，但其保留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物但其保留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物质。质。试剂试剂（1 1）无水乙醚：不含有过氧化物。）无水乙醚：不含有过氧化物。（2 2）无水乙醇：不得含有醛类物质。）无水乙醇：不得含有醛类物质。（3 3）无水硫酸钠。）无水硫酸钠。（4 4）甲醇：重蒸后使用。）甲醇：重蒸后使用。（5 5）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。（6 6）抗坏血酸溶液（）抗坏血酸溶液（100100g gL L）：）：临用前进行配
13、制。临用前进行配制。（7 7）氢氧化钾溶液（）氢氧化钾溶液（5050g g100g100g）：）：取取5050g g氢氧化钾氢氧化钾,溶溶于于5050g g水中，混匀水中，混匀 标准溶液的配制标准溶液的配制（1 1）维生素维生素 A A标准液：视黄醇（纯度标准液：视黄醇（纯度8585）或视黄醇乙酸酯（纯度或视黄醇乙酸酯（纯度9090）经皂化处理后使用。）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素用脱醛乙醇溶解维生素A A标准品，使其浓度大约为标准品，使其浓度大约为lmg/mLlmg/mL。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。（2 2）维生素）维生素E E标准
14、液：标准液：a a-生育酚（纯度生育酚（纯度9595），），-生育酚（纯生育酚（纯纯纯9595），），-生育酚（纯度生育酚（纯度9595）。用脱醛乙醇分别溶解）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素以上三种维生素E E标准品，使其浓度大约为标准品，使其浓度大约为lmg/mLlmg/mL,临用前临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E E的准确浓度。的准确浓度。（3 3）内标溶液：称取苯并芘（纯度）内标溶液：称取苯并芘（纯度9898），用脱醛乙醇配制），用脱醛乙醇配制成成10ug/mL10ug/mL 的内标溶液。的内标溶液。仪器和设备仪器和设备（1 1）高效液
15、相色谱仪带紫外分光检测器。）高效液相色谱仪带紫外分光检测器。（2 2）旋转蒸发器。）旋转蒸发器。（3 3）高速离心机（带小塑料离心管）高速离心机（带小塑料离心管）（4 4）高纯氮气。）高纯氮气。（5 5）紫外分光光度计）紫外分光光度计。样品处理：样品处理：皂化皂化提取提取洗涤洗涤浓缩浓缩 定容定容（1 1）皂化：）皂化：称取适量样品于三角瓶中，加称取适量样品于三角瓶中，加3030mLmL无水乙醇，振无水乙醇，振摇使样品分散。加入摇使样品分散。加入 5mL100g/L5mL100g/L抗坏血酸溶液和抗坏血酸溶液和 2.2.0mL0mL苯并芘内标液，混匀，加苯并芘内标液，混匀，加 10 10mLm
16、L氢氧化钾溶氢氧化钾溶液，沸水回流液，沸水回流3030minmin，使皂化完全，皂化后立即放使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。入冰水中冷却。思考：皂化时加入思考：皂化时加入VcVc的作用是什么？的作用是什么？（2 2）提取：）提取：将皂化后的样品移入分液漏斗中，用将皂化后的样品移入分液漏斗中，用5050mLmL水分水分2-32-3次次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL100mL无水乙醚无水乙醚分分2 2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇轻振摇2 2minmin，静置分层，弃去水层。静置分层，弃去水层。(3)(3)洗涤：洗涤：每次用约每次用约5050mLmL水将乙醚液洗至中性，需洗水将乙醚液洗至中性，需洗4545次次 （4 4）浓缩：）浓缩：将乙醚提取液经无水硫酸钠（约将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g5g）滤入滤入150150 mLmL旋转旋转蒸发瓶内，用约蒸发瓶内，用约1515mLmL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2 2次，并入蒸发瓶内，于次，并入蒸发瓶内，于5
