《分子生物学PCR--课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学PCR--课件（54页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应1PPT课件 PCRPCRPCRPCR技术是一种技术是一种技术是一种技术是一种体外体外体外体外模拟体内模拟体内模拟体内模拟体内DNADNADNADNA复制复制复制复制过过过过程的核酸扩增技术。它是以待扩增的程的核酸扩增技术。它是以待扩增的程的核酸扩增技术。它是以待扩增的程的核酸扩增技术。它是以待扩增的双链双链双链双链DNADNADNADNA为为为为模板模板模板模板，以一对，以一对，以一对，以一对人工合成人工合成人工合成人工合成的寡核苷酸为引物，以四的寡核苷酸为引物，以四的寡核苷酸为引物，以四的寡核苷酸为引
2、物，以四种种种种dNTPdNTPdNTPdNTP为底物为底物为底物为底物，通过，通过，通过，通过耐高温耐高温耐高温耐高温DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶的酶促的酶促的酶促的酶促作用，经过作用，经过作用，经过作用，经过“变性、退火、延伸变性、退火、延伸变性、退火、延伸变性、退火、延伸”三步反应三步反应三步反应三步反应的的的的循循循循环环环环快速特异地扩增出特定的快速特异地扩增出特定的快速特异地扩增出特定的快速特异地扩增出特定的DNADNADNADNA片断。片断。片断。片断。 2PPT课件PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 由由由由“高温变性高温变性高温变性高温变性、低温退火
3、低温退火低温退火低温退火和和和和适温适温适温适温延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应”组成组成组成组成一个周期，循环一个周期，循环一个周期，循环一个周期，循环进行，使目的基进行，使目的基进行，使目的基进行，使目的基因得以迅速扩增。因得以迅速扩增。因得以迅速扩增。因得以迅速扩增。3PPT课件模板DNA95PCR循环过程4PPT课件50引物1引物2DNA引物PCR循环过程5PPT课件引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR循环过程6PPT课件第1轮结束95第2轮开始PCR循环过程7PPT课件72TaqTaqTaqTaqPCR循环过程50958PPT课件72第2轮结束PCR循环过程9PPT课件模
4、板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增PCR循环过程第6轮扩增10PPT课件PCRPCR的反应动力学的反应动力学 PCRPCR的三个反应步骤反复进行，使的三个反应步骤反复进行，使DNADNA扩增量扩增量呈指数上升。平均扩增效率的理论值为呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%100%，但，但在实际反应中平均效率达不到理论值。在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，反应初期，靶序列靶序列DNADNA片段的增加呈指数形式，随着片段的增加呈指数形式，随着PCRPCR产产物的逐渐积累，物的逐渐积累，被扩增的被扩增的DNADNA片段片段不再呈指数增不再呈指数增加加，而进入线性增
5、长期或静止期，即出现，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞停滞效应效应”，这种效应期称这种效应期称平台期平台期。大多数情况下，大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。平台期的到来是不可避免的。11PPT课件 PCR扩增体系扩增体系模板模板 3TTAGGCCTGGATAAGCGCCTGGA 5引物引物 5A ATCCGGA AC TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶dATPdATPdGTPdGTPdCTPdCTPdTTPdTTPMg2+Mg2+底物底物12PPT课件 PCR PCR 反应体系反应体系PCRPCR反应五要素：反应五要素：引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和Mg2+
6、Mg2+ 标准的标准的PCRPCR反应体系：反应体系：1010扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul10ul4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ug Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMg2+Mg2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul100ul13PPT课件引物引物 引物是人工合成的引物是人工合成的两段寡核苷酸单链，两段寡核苷酸单链，是是PCRPCR特异性反应特异性反应的关键，扩增产物的大小也由的关
7、键，扩增产物的大小也由特异引物限定。特异引物限定。3 3 14PPT课件设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则：引物引物长度长度： 15-30bp15-30bp，常用为，常用为20-27bp20-27bp左右。在做长片段左右。在做长片段PCRPCR或或做某些特殊的做某些特殊的PCRPCR时应使用较长的引物，但最多不超时应使用较长的引物，但最多不超过过5050个核苷酸个核苷酸。引物引物碱基碱基： G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜，过高或过低均不利于引为宜，过高或过低均不利于引发。发。ATGCATGC最好随机分布最好随机分布，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。，避免聚嘌呤或嘧啶核
8、苷酸。避免引物自身互补避免引物自身互补，形成发夹结构，因空间位阻而，形成发夹结构，因空间位阻而影响其与模板结合。影响其与模板结合。两条引物间之间也不能互补两条引物间之间也不能互补，否，否则会形成则会形成引物二聚体引物二聚体，产生非特异的扩增条带或降低，产生非特异的扩增条带或降低引物有效浓度。引物有效浓度。15PPT课件引物引物3 3端的碱基端的碱基，应严格要求配对，应严格要求配对，不可修饰，不可修饰，以避免因末端碱基不配对而导致以避免因末端碱基不配对而导致PCRPCR失败。考虑到失败。考虑到密密码子的简并性码子的简并性，引物，引物33端不终止于密码子第三个碱端不终止于密码子第三个碱基基。因该位
9、置由于密码子的简并性影响扩增的特异性。因该位置由于密码子的简并性影响扩增的特异性。 引物的引物的5 5端可以修饰端可以修饰，它，它对扩增特异性影响不对扩增特异性影响不大。大。如增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；如增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入点突变、启动子序列等。引入点突变、启动子序列等。引物的引物的特异性特异性： 引物应该与引物应该与核酸序列数据库的核酸序列数据库的其它序列无明显的其它序列无明显的同源性，同源性，以减少引物与基因组的非特异性结合。以减少引物与基因组的非特异性结合。16PPT课件简并引物简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸如果引物的序列是从
10、基因产物蛋白质的氨基酸序列序列反推反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成合成多种序列的引物多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基彼此间只有一个或几个碱基差异差异。这样的。这样的混合引物称简并引物混合引物称简并引物。 简并性简并性(degeneracy)(degeneracy) 遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸均有多个密码子。子外，其余氨基酸均有多个密码子。17PPT课件例如，例如， 序列序列1 1：tg tg a a atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列2 2：t
11、g tg c c atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列3 3：tg tg t t atgcatgcatgcatgcatgcatgc 若样品并不能明确是若样品并不能明确是1 1，2 2还是还是3 3，为了能从不确，为了能从不确定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引物实际上就是物实际上就是针对序列针对序列1 1，2 2，3 3设计的混合物设计的混合物。这样。这样不论是不论是1 1，2 2还是还是3 3，采用你的引物均能有效扩增。，采用你的引物均能有效扩增。 18PPT课件套嵌引物套嵌引物 设计多组引物，结合位点依次位于前一组
12、引物设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。之间。增加扩增产物的特异性。132419PPT课件 引物的溶解与保存：引物的溶解与保存： 高浓度贮存分装，避免反复冻融高浓度贮存分装，避免反复冻融高浓度贮存分装，避免反复冻融高浓度贮存分装，避免反复冻融, ,临用前稀释临用前稀释临用前稀释临用前稀释2020贮存贮存贮存贮存 引物量：引物量： 每条引物的终浓度每条引物的终浓度每条引物的终浓度每条引物的终浓度0.20.20.20.21umol1umol1umol1umol，以，以，以，以最低引物量最低引物量最低引物量最低引物量产产产产生生生生所需要的结果所需要的结果所需要的结果
13、所需要的结果为好，引物为好，引物为好，引物为好，引物浓度偏高会引起错配和浓度偏高会引起错配和浓度偏高会引起错配和浓度偏高会引起错配和非特异性扩增非特异性扩增非特异性扩增非特异性扩增，且可增加引物之间，且可增加引物之间，且可增加引物之间，且可增加引物之间形成二聚体形成二聚体形成二聚体形成二聚体的机的机的机的机会。会。会。会。20PPT课件DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 热稳定性热稳定性最大特点是最大特点是热稳定性热稳定性，耐高温，非常适合，耐高温，非常适合PCRPCR过程过程的反复高温变性要求。的反复高温变性要求。 最适温度高最适温度高最适温度：最适温度： 74-80 74
14、-80 o oC (PCRC (PCR延伸：延伸：7272-）延伸速度：延伸速度： 约约35-150nt/s.35-150nt/s.酶分子酶分子 最长延伸长度：最长延伸长度： 6.7kb6.7kb21PPT课件 Taq酶的功能缺点酶的功能缺点具有具有5 53 3聚合酶活性和聚合酶活性和5 53 3外切酶活外切酶活性，但没有性，但没有3 35 5外切酶活性。外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！因此不能修复错误的碱基配对！ 合成超过合成超过600bp长度的长度的DNA就有可能出现错配，用就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。于克隆基因时必须测序。 金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是
15、MgMg2+ 2+ ）。）。 22PPT课件 1. 1. 不同的公司或不同批次的产品常有不同的公司或不同批次的产品常有很大的很大的差异差异，由于酶的浓度对，由于酶的浓度对PCRPCR反应影响极大，因此反应影响极大，因此应当作应当作预试验或使用厂家推荐的浓度预试验或使用厂家推荐的浓度。 2. 2. 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少则合成产物量减少. .23PPT课件底物：底物：dNTPdNTP1. dNTP1. dNTP小量分装，小量分装，-20-20冰冻保存。冰冻保存。多次冻融会使多次冻融会使dNTPdNTP降解。降解。2. 2.在在PC
16、RPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200umol/L200umol/L，不能，不能低于低于101015mol/L15mol/L。浓度过高浓度过高，与与MgMg2+2+结合，使结合，使游离的游离的MgMg2+2+浓度降低，抑制浓度降低，抑制Taq DNATaq DNA聚合酶的活聚合酶的活性。性。浓度过低浓度过低又会降低又会降低PCRPCR产物的产量。产物的产量。3. 3.尤其是注意尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等的浓度要相等( ( 等摩尔配制等摩尔配制) )，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。降低合成速度，过早终止反应。引起错配。降低合成速度，过早终止反应。 24PPT课件模板模板( (靶基因靶基因) )要求：要求：1. 1001. 100 l l反应体系中质粒反应体系中质粒DNA 1-10ngDNA 1-10ng，基因组，基因组DNA DNA 50-100ng 50-100ng 足够。足够。2. 2. 纯度要求不太严格，可以是粗品，纯度要求不太严格，可以是粗品，但不能混有但不能混有SDSSD
