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1、临床免疫学检验临床免疫学检验固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术北京大学第一医院北京大学第一医院北京大学第一医院北京大学第一医院 检验科刘平检验科刘平检验科刘平检验科刘平固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术o掌握胶体金免疫技术原理、技术要点掌握胶体金免疫技术原理、技术要点o掌握不同膜载体免疫技术的原理掌握不同膜载体免疫技术的原理o熟悉金免疫检测的临床应用熟悉金免疫检测的临床应用o了解胶体金和免疫金的制备了解胶体金和免疫金的制备o了解固相膜及其技术要求了解固相膜及其技术要求概述：概述： 随着免疫学技术和相关生物化学技术的随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相发展
2、，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫膜免疫快速检测快速检测试验。该类试验的最大特点试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。能掌握操作要求和判定标准。固相膜免疫分析技术：固相膜免疫分析技术： 是是以以微微孔孔膜膜作作为为固固相相载载体体，利利用用液液体体可可以以流流过过微微孔孔膜膜也也可可通通过过毛毛细细管管作作用用在在膜膜上上向向前前移移行行的的特特性性，以以酶酶标标记记或或者者各各种种有有色色颗颗粒粒（如如彩彩色色胶胶乳乳、胶胶体体金金、或或胶胶体体硒硒等等）标标记记抗抗原原或或抗抗体体作作为为标标记记
3、物物，通通过过抗抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。常用的固相膜常用的固相膜玻璃纤维素玻璃纤维素(fiberglass)膜膜尼龙尼龙(nylon)膜膜聚聚偏偏氟氟乙乙稀稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜膜硝酸纤维素硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜膜固相膜的特点固相膜的特点多孔性多孔性 滤纸滤纸 毛细管作用毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性高度敏感性易于漂洗易于漂洗 操作简便操作简便固相膜的技术要求固相膜的技术要求孔径：穿流法的膜一般选择孔径：穿流法的
4、膜一般选择0.4m0.4m左右；横流法左右；横流法的膜可选择的膜可选择5m5m10m10m流速：孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔径流速：孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔径大，流速快。以大，流速快。以ml/cm2/minml/cm2/min表示表示蛋白质结合力：吸附力很强，以蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cmg/cm2 2表示表示均一性均一性 优质的膜具有良好的均一性。优质的膜具有良好的均一性。固相固相NC膜膜固相膜免疫测定的特点固相膜免疫测定的特点优点优点不足之处不足之处简便，快速简便，快速敏感度略低，价格略高（与敏感度略低，价格略高（与ELISAELISA比）比）单份测定单份测定精密度
5、较差，质控困难精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志肿瘤标志心肌标志心肌标志滥用药物滥用药物固相微孔膜测定种类固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic ass
6、ay,DICA）斑点斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 常用的标志物常用的标志物o酶和有色微粒子酶和有色微粒子o彩色胶乳彩色胶乳o荧光素荧光素o胶体金和胶体硒等胶体金和胶体硒等o其中以胶体金和荧光素最为常用胶体金免疫技术胶体金免
7、疫技术（免疫金标记技术或金免疫技术）o胶体金免疫技术（胶体金免疫技术（colloidal gold immunoassay ）是以胶体金作为标记物（示踪剂或显色剂），）是以胶体金作为标记物（示踪剂或显色剂），应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。o1971年由年由Faulk和和Taylor始创，最初用于免疫电始创，最初用于免疫电镜技术。镜技术。o目前得以广泛应用。目前得以广泛应用。胶体金免疫技术胶体金免疫技术 o金免疫测定技术：斑点免疫金金免疫测定技术：斑点免疫金渗滤渗滤试验试验 斑点免疫金斑点免疫金层析层析试验试验o金免疫组织化学染色技术：金免疫
8、组织化学染色技术： 金免疫金免疫电镜电镜染色技术染色技术 金（银）免疫金（银）免疫光镜光镜染色技术染色技术 胶体金与免疫金的制备胶体金与免疫金的制备o1. 胶体金的特性及制备胶体金的特性及制备o2.免疫金的制备免疫金的制备 胶体金与免疫金的制备胶体金与免疫金的制备o1. 胶体金的特性及制备胶体金的特性及制备胶体金的结构胶体金的结构 胶体金特性胶体金特性胶体金的制备胶体金的制备 胶体金鉴定胶体金鉴定 和保存和保存注意事项注意事项 胶体金的结构胶体金的结构o胶胶体体金金（colloidal gold）也也称称金金溶溶胶胶（gold solution），是是由由金金盐盐被被还还原原成成金金原原子子后
9、后形形成成的的金金颗粒悬液。颗粒悬液。 o胶胶体体金金颗颗粒粒由由一一个个基基础础金金核核（原原子子金金Au）及及包包围围在在外外的的双双离离子子层层构构成成，紧紧连连在在金金核核表表面面的的是是内内层层负负离离子子（AuC12），外层离子层），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中则分散在胶体间溶液中o金颗粒间金颗粒间静电静电相互排斥而悬浮形成一种稳定的胶体状态。相互排斥而悬浮形成一种稳定的胶体状态。o胶胶体体金金颗颗粒粒的的基基础础金金核核并并非非是是理理想想的的圆圆球球核核，较较小小的的胶胶体体金金颗颗粒粒基基本本是是圆圆球球形形的的，较较大大的的胶胶体体金金颗颗粒粒（一一般般指指大大于于3
10、0nm以以上上的的）多多呈呈椭椭圆圆形形。在在电电子子显显微微镜镜下下可可观观察察胶胶体体金的颗粒形态金的颗粒形态。胶体金特性胶体金特性o（1）胶体金一般性质：）胶体金一般性质： 胶胶体体金金颗颗粒粒大大小小多多在在1100nm，微微小小金金颗颗粒粒稳稳定定地地、均均匀匀地地、呈呈单单一一分分散散状状态态悬悬浮浮在在液液体体中中，成成为为胶胶体体金金溶溶液液。胶胶体体金金因因而而具具有有胶胶体体的的多种特性，特别是对电解质的敏感性多种特性，特别是对电解质的敏感性。（2）呈色性和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来）呈色性和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来说，粒子大小不同，颜色亦不同：说
11、，粒子大小不同，颜色亦不同：o胶体金颗粒在胶体金颗粒在520nm之间，吸收波长之间，吸收波长520nm，呈葡，呈葡萄酒红色。萄酒红色。o胶体金颗粒胶体金颗粒2040nm之间吸收波长之间吸收波长530nm，液体为，液体为深红色，深红色，60nm的金溶液主要吸收波长的金溶液主要吸收波长600nm，金溶，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。o根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。大小可粗略估计金颗粒的大小。 呈色和光吸收性呈色和光吸收性粒子大小不同，光
12、吸收性不同，颜色亦不同：粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同：o1020nm，吸收峰，吸收峰530nm，呈橙色。，呈橙色。o2080nm，吸收峰，吸收峰600nm，呈紫红色。，呈紫红色。o根据这一特点，可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波根据这一特点，可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。长大小可粗略估计金颗粒的大小。稳定性稳定性o稳定稳定: :颗粒做布朗运动不易受重力影响而下沉颗粒做布朗运动不易受重力影响而下沉. .o又不稳定又不稳定: :自身因素与外部因素自身因素与外部因素. .o自身因素自身因素: :相互碰撞而合并为较大颗粒而下沉。相互碰撞而合并为较大颗粒而下沉
13、。o外部因素外部因素: :电解质、浓度、温度、稳定剂。电解质、浓度、温度、稳定剂。胶体金的制备胶体金的制备 制备原理制备原理 o向一定浓度的向一定浓度的氯金酸氯金酸溶液内加入一定量的溶液内加入一定量的还原还原剂剂，使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。，使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。o常用的还原剂：白磷、硼氢化钠、抗坏血酸、常用的还原剂：白磷、硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸钠柠檬酸钠、鞣酸等。、鞣酸等。技术要点技术要点p最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法柠檬酸盐还原法：柠檬酸盐还原法：先配制先配制HAuCl4HAuCl4水溶液，加热至沸水溶液，加热至沸搅动下准
14、确加入一定量的柠檬酸三钠水溶液搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠水溶液继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快便灰色，继而转成黑色，酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快便灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳成红色随后逐渐稳成红色冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积 四种粒径胶体金的制备及特性四种粒径胶体金的制备及特性胶体金粒径胶体金粒径胶体金粒径胶体金粒径（nmnmnmnm）1 1 1 1柠檬酸三柠檬酸三柠檬酸三柠檬酸三钠加入量钠加入量钠加入量钠加入量（mlmlmlml）* * * *胶体金特性胶体金特
15、性胶体金特性胶体金特性呈色呈色呈色呈色maxmaxmaxmax16.0016.0016.0016.002.002.002.002.00橙色橙色橙色橙色518nm518nm518nm518nm24.5024.5024.5024.501.501.501.501.50橙红橙红橙红橙红522nm522nm522nm522nm41.0041.0041.0041.001.001.001.001.00红色红色红色红色525nm525nm525nm525nm71.5071.5071.5071.500.700.700.700.70紫色紫色紫色紫色535nm535nm535nm535nm鉴定和保存鉴定和保存o指标
16、：粒径大小，均一度，有无凝集指标：粒径大小，均一度，有无凝集o粗略：日光；分光光度计粗略：日光；分光光度计o电镜：统计胶体金的平均粒径。电镜：统计胶体金的平均粒径。 良好的胶体金应该是清亮透明的。良好的胶体金应该是清亮透明的。 若混浊或表面有漂浮物，提示有较多的凝集颗若混浊或表面有漂浮物，提示有较多的凝集颗粒。粒。胶胶 体体 金（金（1560 nm）优优 质质劣劣 质质o室温、避光、无尘、洁净器皿：室温、避光、无尘、洁净器皿：3个月。个月。 加入少许防腐剂（如加入少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利）可有利于保存。于保存。o4,半年。半年。o-20-20o尽快标记 鉴定和保存鉴定和保存注意事项注意事项 o（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。o（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。o（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。水，或者是高质量的
