响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺及其抗氧化作用 徐士钊 齐菲 席雅琳Summary：考察乙醇体积分数、液料比、超声时间等单因素对辽东楤木总皂苷提取量的影响，采用响应面Box-Behnken Design优化辽东楤木总皂苷的提取工艺，并对辽东楤木总皂苷进行提取量测定及抗氧化作用的研究响应面法最终优化结果表明，乙醇体积分数为85%，液料比为20 mL ∶ 1 g，超声时间为60 min，在此条件下测得辽东楤木中总皂苷类提取量为94.93 mg/g，与预测值良好吻合抗氧化活性结果表明，辽东楤木总皂苷类对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，简称DPPH）自由基和2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），简称ABTS]自由基均有较好的清除能力，当总皂苷的质量浓度为 57.83 mg/mL 时，对DPPH自由基的清除率最大，为92.17%;而对ABTS自由基的清除能力在总皂苷质量浓度为19.28～96.39 mg/mL 范围内逐渐增强，当其质量浓度为96.39 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率为100%。
Key：辽东楤木;响应面法;总皂苷;提取工艺;DPPH自由基;ABTS自由基;清除率;抗氧化作用： R284.2 文献标志码： A ：1002-1302（2020）03-0204-05辽东楤木[Aralia elata（Miq.）Seem.]别称龙牙楤木、刺龙牙、刺嫩芽、刺老鸦、东北野香椿等，是一种食药兼用型的五加科（Araliaceae）楤木属（Aralia）植物，为多年生落叶灌木或小乔木[1]在亚洲地区分布广泛，我国主要分布在辽宁、吉林、黑龙江等地的山区，尤其在长白山地区以及小兴安岭一带分布最为广泛;在日本、朝鲜和俄罗斯的西伯利亚地区分布也相对较多[1-2]传统中医药记载其主要药用部位为树皮和根皮，具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛的功效，可用于风湿性关节炎、肾气不足等症的辅助治疗[3-4]现代研究表明，辽东楤木中主要含有皂苷类、氨基酸类、油脂类、黄酮类以及一些微量元素等化学成分，其中现代文献对总皂苷类成分的研究最为广泛，目前已经分离出了皂苷的多种苷元[5-8]此外，对于辽东楤木药理作用的研究也较丰富，辽东楤木可以刺激肾上腺皮质系统而具有一定的抗炎作用，尤其对缓激肽介质的合成与释放有明显的抑制作用，临床上还用于治疗肾虚阳痿、气虚无力等症[4，9-10]。
通过对辽东楤木总皂苷提取工艺的优化以及抗氧化作用的研究，为辽东楤木保健产品的开发研究提供科学依据1 材料与方法1.1 材料、仪器与试剂辽东楤木嫩芽样品采于辽宁省丹东市，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为五加科（Araliaceae）楤木属（Aralia Linn.）辽东楤木[Aralia elata （Miq.） Seem]的芽，低温烘干，粉碎并过60目筛备用主要仪器有UV-1500型紫外-可见分光光度计，购自翱艺仪器（上海）有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，购自常州赛普实验仪器厂;AR2140电子分析天平，购自奥豪斯仪器（上海）有限公司;KQ5200DB型数控超声波清洗器，购自昆山超声仪器有限公司;101型电热鼓风干燥箱，购自北京市永光明医疗仪器有限公司;HP-01无油真空泵，购自邦西仪器科技（上海）有限公司主要试剂有齐敦果酸对照品（批号为110709-200304）、DPPH试剂（批号为6KCYN-LT）、ABTS試剂（批号为619H032）、L（+）-抗坏血酸，均购于中国药品生物制品检定所，对照品纯度达到98%以上;高氯酸、香草醛、冰乙酸、二氯甲烷、乙醇均为分析纯，水为蒸馏水。
1.2 试验方法1.2.1 对照品溶液的制备 精确称取齐敦果酸对照品适量，加入甲醇制成含有1.002 mg/mL齐敦果酸对照品溶液[11]1.2.2 标准曲线的制备 精确吸取齐敦果酸对照品溶液40、60、80、100、120 μL，置于5 mL的容量瓶中，挥干溶剂，加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度[12]采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度（y）测定，以测得的吸光度（y）为纵坐标、对照品的质量（x）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为y=8.384 5x-0.010 22，r=0.999 9，线性范围为0.04～0.12 mg测定结果见表11.2.3 单因素对总皂苷提取量的影响试验 通过单一变量分别考察乙醇体积分数、液料比、超声时间等因素对辽东楤木总皂苷提取量的影响，以获得单因素影响提取工艺的最佳范围[13]1.2.3.1 乙醇体积分数对总皂苷提取量的影响 称取辽东楤木粉末5份，每份1.0 g，精确称定，分别置于具塞锥形瓶中，精确加入70%、75%、80%、85%、90%乙醇30 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率 100 W）60 min，放冷，再称定质量，用相应体积分数的乙醇补足失质量，摇匀，滤过，分别取续滤液20 μL，置于5 mL量瓶中，挥干溶剂，加入5 mL 0.4%香草 醛- 冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于 60 ℃ 水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度。
采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度测定，并测定不同乙醇浓度下的总皂苷提取量1.2.3.2 超声提取时间对总皂苷含量的影响 称取辽东楤木粉末5份，每份1.0 g，精确称定，分别置具塞锥形瓶中，精确加入85%的乙醇30 mL，密塞，称定质量，分别选取35、50、65、80、95 min等5个时间点进行超声处理（功率100 W），放冷，再称定质量，用85%乙醇补足失质量，摇匀，滤过，分别取续滤液20 μL，置于5 mL量瓶中，挥干溶剂，加入 0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光值测定，并测定不同超声时间的总皂苷提取量1.2.3.3 液料比对总皂苷提取量的影响 称取辽东楤木粉末5份，每份1.0 g，精确称定，分别置于具塞锥形瓶中，精确加入85%乙醇各15、20、25、30、35 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率100 W）60 min，放冷，再称定质量，用85%乙醇补足失质量，摇匀，滤过，分别取续滤液20 μL，置于5 mL量瓶中，挥干溶剂，加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴中加热20 min，放冷后用冰乙酸稀释至刻度。
采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度测定，并测定不同液料比的总皂苷提取量1.2.4 响应面法优化提取总皂苷类工艺的试验设计 根据单因素的试验结果，选取超声时间、液料比、乙醇体积分数等3个因素为影响总皂苷提取量的主要因素，进行3因素3水平的响应面设计，设计的因素及水平见表21.2.5 辽东楤木总皂苷的抗氧化试验1.2.5.1 辽东楤木总皂苷对1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，简称DPPH自由基）清除能力的测定1.2.5.1.1 DPPH工作液的制备 精确称取DPPH固体适量，置于250 mL量瓶中，用无水乙醇进行定容，摇匀，制成质量浓度为10 mg/mL的DPPH工作液1.2.5.1.2 辽东楤木总皂苷清除DPPH自由基的测定方法 分别精确吸取DPPH工作液4 mL和不同质量浓度的总皂苷溶液2 mL置于试管中，混合均匀后在室温下避光处理60 min，然后在波长为 517 nm 的条件下进行吸光度D1的测定;再分别精确吸取 4 mL 无水乙醇和不同质量浓度的2 mL总皂苷溶液，按照上述方法同等处理后进行吸光度D2的测定;分别精确吸取4 mL DPPH工作液和2 mL无水乙醇作为空白对照，按照上述方法同等处理后进行吸光度D0的测定，以L（+）-抗坏血酸作为阳性对照。
DPPH自由基清除率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%[14-16]1.2.5.2 辽东楤木总皂苷对ABTS自由基清除能力的测定1.2.5.2.1 ABTS工作液的制备 称量386 mg的ABTS用蒸馏水溶解后，定容至100 mL;再称取 376.8 mg 的过硫酸钾用蒸馏水溶解后，定容至 25 mL;取100 mL ABTS溶液和4.6 mL过硫酸钾溶液混合，使ABTS溶液的浓度为7 mmol/L，过硫酸钾溶液的浓度为2.45 mmol/L，以上2种溶液混合后于室温下避光处理16 h，使用前用无水乙醇进行进行稀释，使其在波长为734 nm处的吸光度值在0.7左右[17]若在ABTS工作液中加入辽东楤木的总皂苷溶液后，吸光度下降，说明该溶液对ABTS自由基存在清除作用，否则反之1.2.5.2.2 辽东楤木醇提物清除ABTS自由基的测定方法 精确吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL不同质量浓度的总皂苷溶液，并将其置于试管中混合均匀，在室温下避光处理60 min，然后在波长为 734 nm 的条件下进行吸光度D1的测定;分别精确吸取4 mL无水乙醇和0.6 mL不同质量浓度的总皂苷溶液，按照上述方法同等处理后进行吸光度D2的测定;分别精确吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL无水乙醇作为空白对照，按照上述方法同等处理后进行吸光度D0的測定，以L（+）-抗坏血酸作为阳性对照。
ABTS自由基清除率=[D0（D1-D2）]/D0×100%[18]2 结果与分析2.1 单因素试验结果与分析2.1.1 不同体积分数乙醇对总皂苷提取量的影响 在超声提取时间为60 min、液料比为30 mL ∶ 1 g的条件下，不同乙醇浓度对辽东楤木总皂苷提取量的影响见图1辽东楤木总皂苷提取量随着乙醇体积分数的增加先升高再降低，当乙醇体积分数升至85%时，辽东楤木总皂苷提取量达到最大;当乙醇体积分数大于85%时，总皂苷提取量急剧降低根据提取化学成分相似相容的原理，结合辽东楤木总皂苷含有的化学成分类型，将乙醇体积分数控制在75%～85%2.1.2 超声提取时间对总皂苷提取量的影响 在乙醇体积分数为85%、液料比为30 mL ∶ 1 g的条件下，不同超声提取对辽东楤木总皂苷提取的影响见图2超声提取时间在35～65 min范围内，辽东楤木总皂苷提取量呈升高趋势，在65 min时达到最大值，再增加提取时间，总皂苷提取量降低随着提取时间的延长，总皂苷不断被提取出来，65 min后总皂苷提取量降低，一方面可能是总皂苷发生水解、结构发生变化，另一方面提取出来的其他成分影响总皂苷的提取量，因此提取时间应控制在50～80 min。
2.1.3 液料比对辽东楤木总皂苷提取量的影响 在乙醇体积分数为85%、超声提取时间为65 min的条件下，不同液料比对辽东楤木总皂苷提取量的影响见图3液料比从15 mL ∶ 1 g增大到20 mL ∶ 1 g时，由于浓度差异扩大导致辽东楤木总皂苷向溶液迅速渗透，使其提取量显著增加;在（25～35） mL ∶ 1 g液料比的范围内，对辽东楤木总皂苷的提取量影响不大，液料比应控制在（15～25） mL ∶ 1 g2.2 响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺试验结果2.2.1 响应面设计方案与结果 在单因素试验考察的基础上，依据Box-Behnken中心设计原理，确定响应面分析的因素和水平，选择超声时间（x1）、液料比（x2）、乙醇体积分数（x3）等3个因素为影响总皂苷提取量的主要因素，辽东楤木总皂苷提取量为响应值进行考察运用Design-Expert 8.0.5软件进行响应面设计和分析，对。