无锡地区应用γ-干扰素试验法检测牛结核病的临床应用 盛 瑜，范 峰（无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡 214021）Reference：通过对无锡地区2011～2013年所有规模场奶牛应用γ-干扰素试验进行结核病监测，从而淘汰监测结核阳性牛最终达到牛场结核净化2011年检出淘汰阳性牛45头，2012年检出淘汰21头，2013检出淘汰6头结果显示阳性牛检出率逐年下降明显，γ-干扰素试验法有更好的特异性和敏感性，对净化牛群效果显著Keys：无锡地区；应用；γ-干扰素试验法；检测；牛结核病；临床应用牛结核病作为一种重要的人兽共患病不仅严重影响奶牛养殖业的发展，更是公共卫生的重大威胁近年来，随着人们生活水平的日益提高，人们对牛肉、奶制品特别是牛奶的需求量与日俱增，为了保证百姓能喝上放心奶，各级政府高度重视，出台系列净化奶牛结核病的政策措施目前我省奶牛结核病按照现阶段国家动物疫病监测计划分类标准属二类地区，奶牛结核病不治疗，而采取严格的隔离、扑杀患病牛的政策我国国标用于牛结核病的检测方法为牛结核菌素皮内变态反应试验，但是皮内变态反应检测存在非特异性高和人为判读假阴性的特点，常造成检测结果的误判，在实际的牛结核检疫中造成了很大压力。
因此，笔者在2011～2013年间，对无锡地区所有规模奶牛场运用了新型的γ-干扰素（IFN-γ）释放试验进行检测，为无锡市奶牛结核病防控措施进行验证和分析，从而为今后开展本市奶牛结核病的检测提高科学有效的依据1 材料与方法1.1 待检奶牛2011～2013年间，连续3年监测无锡市所有规模奶牛场（存栏100头以上），共计13家除初生犊牛、怀孕后期母牛及隔离病牛未开展监测，3年连续监测数量分别为：4000头/次、5000头/次、5000头/次，共计14000头/次1.2 BOVIGAMTMMycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle、刺激原Avian PPD、Bovine PPD 购自瑞士Prionics公司1.3 牛IFN-γ试验样品的采集与处理：奶牛尾静脉无菌采血5ml/头，将采集的血液置于肝素钠抗凝管中，轻轻颠倒混匀，使肝素钠溶解室温下将血样送到实验室并在采血后30h内进行刺激培养将全血样品无菌分装至24孔细胞培养板中，每份血样分装3孔（1.5ml/孔），无菌加入100μLPBS（阴性抗原对照），禽PPD和牛PPD至相应的孔。
震荡混匀1min将含有血液和抗原的24孔板置于37℃湿温培养箱中孵育培养24h次日从各培养孔吸取400μl上层血浆，转入独立的1.5mh离心管中，即为刺激产生的γ-干扰素上清血浆置于-20℃贮存待检BOVIGAMTM试剂盒检测和结果判定：具体操作按试剂盒说明书进行2 结果对所有规模场奶牛共计14000头开展了奶牛全血IFN-γ释放试验，结果显示：3年累计ELISA判定阳性奶牛72头，ELISA判定阴性奶牛13928头2011年至2013年，奶牛结核阳性检出数分别为45头、21头、6头，阳性检出数逐年下降，且趋势较为明显具体结果见表23 分析2011年～2013年间，本地区也进行了传统的牛结核菌素皮内变态反应试验，其阳性检出率要明显高于IFN-γ试验，而其阳性、阴性符合数却低于IFN-γ试验，因此IFN-γ试验具有更好的特异性和敏感性，对于本地区开展综合防控措施，特别是扑杀措施有非常有力可靠的证据，很适宜本地区奶牛结核病净化措施落实到位本研究连续3年通过运用IFN-γ试验开展奶牛结核监测，配套一系列综合防控净化措施，本地区结核阳性率呈逐年明显下降趋势，全市奶牛结核净化效果显著根据监测数据，2011年淘汰阳性牛45头，2012年检出淘汰21头，2013检出淘汰6头。
奶牛结核的有效净化随之带来的经济效益也非常显著，如产奶量上升、疫病防治费用降低、节省劳动力成本、减少淘汰假阳性牛等农业部2013年《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》对于奶牛结核的检测方法仍为传统PPD皮内变态反应，仅对对监测阳性的动物采用IFN-γ检测法进行确诊，而2014年明确将IFN-γ检测法列入结核检测方法行列因此，本实验的研究与国家结核病的防控要求相一致，同时也证实了IFN-γ检测法在结核病防控净化种的优越性4 总结牛结核病主要是由牛分支杆菌引起的一种慢性消耗性传染病[1]该病传染性强，且能通过奶制品传染给人和其他动物，危害严重世界动物卫生组织（[来自WwW.L]OIE）将其列为B类动物疫病[2]，我国将其列为二类动物疫病对于牛结核病的检测方法目前主要有三种，为细菌学检测、分子生物学检测和免疫学检测细菌学方法分离率低（仅约20%），且检测耗时长[3]，不适用于活畜检疫；分子生物学方法灵敏度高，特异性好，但实验条件要求较高，不便于普及；免疫学方法主要有结核菌素皮内变态反应试验、比较变态反应试验、IFN-γ释放试验等目前在我国牛结核病检疫过程中，主要采用牛型PPD进行皮内变态反应，但皮内变态反应操作过程困难，试验所需时间较长、受外界干扰因素较多、结果判定主观性较强，同时从本地区有关实验数据显示，部分PPD反应呈假阳性和假阴性结果。
其中有一部分是由禽结核分枝杆菌感染引起的假阳性主要是由于皮内变态反应所应用的免疫学诊断试剂结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）是多种抗原的混合物，存在交叉反应导致非特异性阳性反应若单独用该方法检出PPD阳性牛即实行“检疫-扑杀”淘汰措施，会导致部分假阳性被误杀同时该方法敏感性较低，在疫病的早期阶段和急性感染病例会发生假阴性反应，又会导致扑杀不净故OIE认为仅用单一的结核菌素试验进行结核病净化很难，而且PPD反应由于受迟发型变态反应的影响，在30天内不能进行复检，易造成该病的扩散和疫情处置的延误 （下转第74页）IFN-γ试验是检测血浆中抗原含量的一种方法刺激淋巴细胞所用的抗原是结核分枝杆菌中存在的特异性抗原，有牛型和禽型之分，可以有效区分牛分支杆菌和环境中禽的干扰，因此该方法有较高的特异性；而由特异性抗原进行刺激所产生的γ干扰素的量直接反映机体是否接触过结核杆菌，因此具有较高的敏感性该方法克服了皮试变态反应的主观性和禽型的干扰，而且阳性检出率高该方法已被OIE认可，并作为结核唯一的辅助诊断试验，成为皮内变态反应之外的一种活畜诊断实验方法因此，本研究通过连续3年采用IFN-γ方法开展奶牛结核病监测，数据显示IFN-γ试验不仅简单、快捷，灵敏度和特异性高，结果更为客观、可靠，有效的解决了基层动物监督机构在实施奶牛结核病检疫、隔离、扑杀措施过程中的一系列问题，如多次繁琐的测量观察，大量的人力物力参与、主观判定阳性实施扑杀的困难等，因此非常适宜结核病检疫的推广。
但是，IFN-γ试验仍存在问题，主要为成本较高，国内尚无正规批准试剂盒，正在开发过程中[4、5]，因此，结合农业部2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划“对监测阳性的动物，可用外周血IFN-γ体外释放检测法（按试剂盒说明书）进行确诊”[6]的建议，在本研究的基础上，将探讨采用结核菌素皮内变态反应初筛，初筛阳性或疑似的进行IFN-γ试验确诊的方法通过两种检测方法的联合运用，有效降低由于检测结果的误判导致的假阳性和假阴性造成的扑杀不净和误杀奶牛数量，大大减少由此带来的经济损失，进一步做好检疫、淘汰和净化工作，达到结核净化的目的和建立健康的奶牛群Reference[1] 世界动物卫生组织．哺乳动物、禽、蜜蜂 A 和B 类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].北京：中国农业出版社，2002．[2] Worl[来自www.LW]d Organization for Animal Health[OIE] .Manual of diag-nostic tests and vaccines for terrestrial animals[M].Paris，Bo-vine tuberculosis，2009：16-22.[3] 刘芳，李亮，畅志强.结核分枝杆菌诊断方法的研究进展[J].中国国境卫生检疫杂志，2011，34（1）：66-68．[4] 张成全，陈祥，牛中伟，等.重组C -干扰素单克隆抗体的研究[J].中国动物传染病学报，2009，17（4）：15-19.[5] 陈祥，牛中伟，徐正中，等.C -干拢素 ELISA 检测方法的建立与初步应用[J].中国动物传染病学报，2010，18（4）：54-59. -全文完-。