精选学习资料 - - - - - - - - - 植物体内游离氨基酸总量的测定方法一：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应,与游离氨基酸的含量成正比；二、仪器设备产生蓝紫色化合物, 其颜色的深浅分光光度计；电子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 个；漏斗〔直径 6 厘米〕 3个、滤纸适量； 20ml 刻度试管 7 支；移液管 0.5ml 3 支、 5ml 1 支；试管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜〔封试管口〕 ；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅〔含铁丝筐〕 ；三、试剂1. 3%茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到100ml 容量瓶里,贮于棕色瓶中；此试剂应放在冷凉处,不宜久放,使用期约 10 天；2. 氰酸盐缓冲液〔按以下方法配制〕 ：〔1〕NaCN贮备液 0.01mol/L 〔490mg/L〕；〔2〕醋酸缓冲液：称 360g 醋酸钠〔含三分子结晶水〕溶于约 300ml 无氨蒸 馏水中,加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至 1L；取溶液〔 1〕20ml,用溶液〔 2〕定容到 1L；3. 标准氨基酸精确称取在 80℃下烘干的亮氨酸13.1mg〔或α μ mol,或氨基氮 7μ g；4. 95%乙醇；异丙醇〔分析纯〕 ；四、操作步骤名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 1. 标准曲线的制作取 20ml 刻度试管 18 支,按下表 1 加入各试剂；加完试剂后混匀, 在 100℃水浴中加热 12min〔加热时封口〕,取出在冷水中迅速冷却,立刻于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色；于 570nm波长下测其光密度〔以空白管为参比〕 ,以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程；2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片 〔或其它组织〕,洗净擦干, 剪碎混匀,快速称取 0.10~0.20g 〔视氨基酸含量多少而定〕 ,共称 3 份,分别加入 20ml 刻度试管中,再加蒸馏水10ml 盖塞〔或系上塑料薄膜〕 ,置沸水浴中 20min 以提取游离氨基酸, 到时取出在自来水中冷却, 把上清液滤入 25ml容量瓶中,之后再往试管中加5ml 蒸馏水,置沸水浴上再加热10min,过滤并反复冲洗残渣,最终定容至刻度,摇匀；3. 样品测定 另取 4 支干净干燥的试管,其中 3 支分别加入 0.5ml 提取液,另一支加 0.5ml 蒸馏水,然后在上述 4 支试管中分别加入 NaCN缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml ,加完试剂后盖塞,置沸水浴上加热 12min,冷却后,再分别加 5ml 95%乙醇,摇匀,以空白作参比, 在波长 570nm下测其光密度；依据光密度查标准曲线 〔或用回来方程运算〕 即可求出提取液中氨基酸的浓度；方法二：一、 原理 游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应,与游离氨基酸的含量成正比；二、 仪器设备产生蓝紫色化合物, 其颜色的深浅分光光度计；电子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 个；漏斗〔直径 6 厘米〕 3个、滤纸适量； 20ml 刻度试管7 支；移液管 0.5ml 3 支、 5ml 1 支；试管架；名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜〔封试管口〕；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅〔含铁丝筐〕；三、 试剂1. 3%茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95% 乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里,贮于棕色瓶中； 此试剂应放在冷凉处,不宜久放,使用期约 10 天；2. 氰酸盐缓冲液 〔按以下方法配制〕：〔1〕NaCN 贮备液 0.01mol/L 〔490mg/L 〕；〔2〕醋酸缓冲液：称 360g 醋酸钠〔含三分子结晶水〕溶于约 300ml 无氨蒸馏水中,加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至 1L；取溶液〔 1〕20ml ,用溶液〔 2〕定容到 1L；3. 标准氨基酸精确称取在 80℃下烘干的亮氨酸13.1mg 〔或 α-丙氨酸 8.9mg 〕溶于 10%的异丙醇中,并在 100ml 容量瓶中用 10%异丙醇稀释至刻度,混匀,即为 1mmol/L 的标准氨基酸贮备液,置冰箱中储存；为了制备工作液,可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合,此液浓度为 7μ g；0.5mmol/L ,即 1ml 含氨基酸 0.5 μ mol,或氨基氮4. 95%乙醇；异丙醇〔分析纯〕；四、 操作步骤名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 1. 标准曲线的制作取 20ml 刻度试管 18 支,按下表 1 加入各试剂；加完试剂后混匀,在 100℃水浴中加热 12min 〔加热时封口〕,取出在冷水中快速冷却,立刻于每管中加入5ml 95% 乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色；于 570nm 波长下测其光密度〔以空白管为参比〕,以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程；表 1 各试管加入试剂量2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片〔或其它组织〕,洗净擦干,剪碎混匀,快速称取 0.10~ 〔视氨基酸含量多少而定〕,共称3 份,分别加入 20ml刻度试管中,再加蒸馏水 10ml 盖塞〔或系上塑料薄膜〕,置沸水浴中 20min 以提取游离氨基酸,到时取出在自来水中冷却,把上清液滤入 25ml 容量瓶中,之后再往试管中加 5ml 蒸馏水,置沸水浴上再加热 最终定容至刻度,摇匀；10min ,过滤并反复冲洗残渣,3. 样品测定另取 4 支干净干燥的试管,其中3 支分别加入 0.5ml 提取液,另一支加 0.5ml 蒸馏水,然后在上述4 支试管中分别加入 NaCN 缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml ,加完试剂后盖塞,置沸水浴上加热 12min ,冷却后,再分别加5ml 95% 乙醇,摇匀,以空白作参比,在波长570nm 下测其光密度； 依据光密度查标准曲线 〔或用回来方程运算〕 即可求出提取液中氨基酸的浓 度；名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 4. 运算游离氨基酸含量式中C：由直线方程运算的值,即0.5ml 试样中氨基酸的微摩尔数〔μ mol〕；V：样品提取液经稀释后的总体积〔 ml〕；W：样品重〔 g〕；测定结果按表 2 记录；表 2 游离氨基酸总量测定记载表名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 5 页。