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1、染色体微阵列技术原理染色体微阵列技术原理与临床应用与临床应用金域医学检验中心1一.出生缺陷概念及概况二.遗传病常见诊断方法及比较三.染色体微阵列技术临床应用四.病例分享五.染色体微阵列技术局限性、结果判读及带来的挑战2一.出生缺陷概念及概况3出生缺陷出生缺陷也称先天异常，是指由于遗传因素、环境因素或两者共同作用于孕前或孕期，引起胚胎或胎儿在发育过程中发生解剖学结构和/或功能上的异常。2012年卫生部统计我国出生缺陷率达年卫生部统计我国出生缺陷率达5.6%，每年新增每年新增出生缺陷患儿出生缺陷患儿90-120万例。万例。随着二胎政策的全面放开，孕妇年龄增加及环境因素影响，估计出生缺陷数量还会增加
2、。保守估计，我国有上千万的罕见病群体，几乎无法得到有效诊断和治疗，甚至遭到严重歧视。4出生缺陷出生缺陷出生缺陷遗传因素遗传因素环境因素环境因素（理、化、生物因素、生活方式）（理、化、生物因素、生活方式）遗传遗传+环境因素环境因素染色体异常（所有新生儿中，染色染色体异常（所有新生儿中，染色体异常占体异常占0.92%，多为新发而非遗，多为新发而非遗传）传）单基因突变（多为孟德尔遗传，少单基因突变（多为孟德尔遗传，少数为新发）数为新发）5基因基因组组：细细胞核胞核DNA成分和成分和线线粒体粒体DNA分子的分子的总总和和基基 因因: 基因基因组组内一个个具体的内一个个具体的结结构和功能构和功能单单位位
3、染色体：基因的染色体：基因的载载体体细细胞核胞核DNA: 46条染色体，条染色体，30亿亿个碱基，个碱基，编码编码21000个个基因。基因。线线粒体粒体DNA: 双双链闭链闭合合环环状分子，状分子，16569个碱基，个碱基，编码编码37个基因，个基因，编码编码2种种rRNA、22种种tRNA和和13种氧化磷酸种氧化磷酸化相关蛋白。化相关蛋白。6789Progeria syndrome A point mutation of the LMNA gene longevity More than 150 genes prevents cholesterol buildup10v 精确控制胚胎发育和分
4、化的每一个步骤精确控制胚胎发育和分化的每一个步骤; ;v 决定了个体的所有生命特征决定了个体的所有生命特征; ;v 决定了个体决定了个体患各种疾病的可能性患各种疾病的可能性.11遗传病：遗传物质发生突变所引起的疾病。遗传病：遗传物质发生突变所引起的疾病。种类：确定的遗传疾病超过种类：确定的遗传疾病超过7000种。种。 1、单基因病单基因病-涉及一对基因，涉及一对基因，AR、AD、XR、XD、Y连锁连锁遗传病遗传病。隐性遗传。隐性遗传4000，显性遗传，显性遗传3000。 2、多基因病多基因病-多对基因和环境共同作用所导致的疾病。多对基因和环境共同作用所导致的疾病。 3、染色体病染色体病-数目异
5、常及结构异常引起的疾病。数目异常及结构异常引起的疾病。 4、体细胞遗传病体细胞遗传病-体细胞突变如肿瘤。体细胞突变如肿瘤。 5、线粒体病、线粒体病-线粒体功能异常为主要起因的一大类疾病。线粒体功能异常为主要起因的一大类疾病。特征：垂直传递、终生性、发病率低、危害严重、家族性特征：垂直传递、终生性、发病率低、危害严重、家族性发病、多无有效治疗。成为危害人类健康的主要疾病。发病、多无有效治疗。成为危害人类健康的主要疾病。遗传病遗传病12Genetic/Genomic DisordersGenomic disorders (number)vTrisomy 21vTrisomy 18vTrisomy
6、13vMosaic trisomies of other chromosomesGenomic disorders (structure)vMore than 400 known disorders Monogenic disordersvDominant (4,000)vRecessive (3,000) Multigenic disordersvGenes + Environments13二.遗传病常见诊断方法及比较14遗传病的诊断染色体核型分析Karyotyping 荧光原位杂交 Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) 染色体微阵列技术Chro
7、mosomal microarray analysis (CMA) 测序技术 First-generation-Sanger method Novel sequencing techniques15传统核型分析技术u除了染色体非整倍体，染色体微缺失和微重复等基因组失衡是导致胎儿发育迟缓、畸形和其他先天性疾病的主要原因。Structural variation in the human genome and its role in diseaseJ. Annu Rev Med. 2010,61:437-551617是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术传统核型分析技
8、术绒毛活检取材绒毛活检取材 孕中期羊膜腔穿刺羊水孕中期羊膜腔穿刺羊水 细胞培养细胞培养 染色体核型分析染色体核型分析染色体数量变化、平衡、不平衡易位、转位和显微镜下染色体数量变化、平衡、不平衡易位、转位和显微镜下可见的大片段缺失和重复。可见的大片段缺失和重复。 18核型分析局限性材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、重复或易位染色体亚端粒区域异常诊断率较低不能检测LOH和UPD单细胞分析单细胞分析 高分辨率分析高分辨率分析19荧光原位杂交技术（fluorescent in-situ hybridization，FISH)可对相应位点的缺失、重复
9、、易位及多倍体等染色体异常作出诊断可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断 提高了染色体异常的诊断精度提高了染色体异常的诊断精度FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交-无需细无需细胞培养，可用于单细胞分析胞培养，可用于单细胞分析Chromosome 13q13-14荧光标记的荧光标记的DNA探针探针中期分裂相中期分裂相间期细胞核间期细胞核Chromosome 21q2120FISH局限性只能检测已知突变的疾病，对背景未知的基因引发的疾病无法检测。不能分辨LOH和UPD一次最多只能检测5-8个位点，无法进行整个基因组
10、的检测，增加探针又会面临准确性下降的问题。对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力 21染色体微阵列技术（chromosomal microarray analysis）微阵列比较基因组杂交( (array comparative genomic hybridization, aCGH) )SNP array22微阵列比较基因组杂交技术微阵列比较基因组杂交技术( (array comparative genomic hybridization, aCGH) ) aCGH技术图示：正常对照样品和患者样品基因组技术图示：正常对照样品和患者样品基因组DNA用两种不同的荧光染料进用两种不同的荧光
11、染料进行标记（正常样品用行标记（正常样品用Cy3标记呈现绿色，患者样品用标记呈现绿色，患者样品用Cy5标记呈现红色）。绿色峰标记呈现红色）。绿色峰（Cy3）表明红色信号缺失，与对照样品相比患者）表明红色信号缺失，与对照样品相比患者DNA样品发生缺失。相反如果样品发生缺失。相反如果Cy5信号增强显示为红色峰（红色箭头），表明患者信号增强显示为红色峰（红色箭头），表明患者DNA样品特定基因组区域发样品特定基因组区域发生获得。生获得。aCGH芯片能够定位芯片能够定位DNA拷贝数量变化在基因组的位置。拷贝数量变化在基因组的位置。23lSNP芯片含有大量寡核苷酸探针，起初设计被用于检测SNP等位基因。l
12、SNP芯片不仅能够研究拷贝数变异（CNV），而且还能够对SNP基因型进行分析SNP array24染色体微阵列染色体微阵列(chromosomal microarray analysis,CMA)技术优势技术优势l全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常如染色体微缺失全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常如染色体微缺失(deletion)和微重复和微重复(duplication)，并能较准确的测定其大小，并精确定位。，并能较准确的测定其大小，并精确定位。l不需要细胞培养，可直接检测血液、羊水不需要细胞培养，可直接检测血液、羊水(amniotic fluid, AF)和绒毛膜绒毛和
13、绒毛膜绒毛(chorionic villus sampling, CVS) 样本，出报告速度更快，结果更加准确可靠。样本，出报告速度更快，结果更加准确可靠。l检测检测10%水平的嵌合体水平的嵌合体l鉴定杂合子缺失鉴定杂合子缺失LOH和单亲二倍体和单亲二倍体(uniparental disomy ，UPD)，亲缘关系的，亲缘关系的分析。分析。l分辨率高：分辨率高：30Kbl结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测-PGS/PGD25自身局限性：自身局限性：不能检测染色体平衡易位不能检测染色体平衡易位(相互易位相互易位、罗伯逊易位罗伯逊易位、
14、倒位倒位、平衡插入）平衡插入）不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病(如脆性如脆性X染色体综合征）染色体综合征）不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象不能检测三倍体以上的多倍体不能检测三倍体以上的多倍体会检测出临床意义不明拷贝数变异会检测出临床意义不明拷贝数变异(copy number variants, CNVs)。26CMA基因芯片染色体核型分析FISH检测范围整套染色体数目异常和微缺失、微重复结构异常整套染色体数目异常，大片段缺失、重复，平衡及不平衡易位，倒位靶向检测细胞培养不需要需要
15、两者均可单亲二倍体YesNoNo近亲结婚YesNoNo分辨率30Kb5-10Mb100Kb嵌合体YesYesYes染色体芯片与传统细胞遗传学技术比较27染色体微缺失和微重复综合征染色体微缺失和微重复综合征概念：概念：染色体微阵列技术（chromosomal microarray analysis，CMA）和荧光原位杂交技术（florescence in situ hybridization， FISH）的应用，使许多用传统染色体核型分析难以识别的染色体综合征得以发现。这些综合征缺失和重复的大小多在几百Kb到几兆碱基对。与单基因病不同，其症状受多基因影响，因而又称连续性基因缺失或重复综合征(co
16、ntiguous gene deletion or duplication syndrome）。大部分综合征不能被染色体核型分析所识别，因而成为微缺失和微重复综合征(microdeletion and microduplication syndrome）。 28拷贝数变异拷贝数变异(copy number variants, CNVs)： 指大于指大于1 kb染色体变异染色体变异(基因组变异基因组变异)，包括核型分析，包括核型分析检测不到的基因组微缺失和微重复，被发现广泛存在于人检测不到的基因组微缺失和微重复，被发现广泛存在于人类基因组中。已有大量研究证实类基因组中。已有大量研究证实CNVs与许多疾病相关，与许多疾病相关，包括数百种染色体微缺失、微重复综合征，是先天畸形和包括数百种染色体微缺失、微重复综合征，是先天畸形和神经发育障碍的主要遗传病因，包括智力低下神经发育障碍的主要遗传病因，包括智力低下(mental retardation, MR)，自闭症，自闭症 (autism), 精神分裂症精神分裂症(Schizophrenia)等。等。29三、染色体微阵列技术 临床应用30出生缺陷
