中医肝郁证的动物模型研究_医学论文 【关键词】肝郁 摘要：综述了肝郁动物模型的复制方法：药物造模法和情志刺激造模法及药物+情志刺激造模法；概述了肝郁动物模型的病理改变，包括循环系统、消化系统、免疫系统及神经内分泌系统的病理改变评析了肝郁动物模型研究存在的问题认为建立符合中医肝失疏泄病理特点的慢性心理应激肝郁模型及肝郁模型评价标准，对动物模型病理改变进行多系统、多病种、多指标及多证型之间的比较观察，将是今后的努力方向 关键词：肝气郁结；疾病模型，动物；综述，指导性 肝郁气滞是中医许多疾病的共同证候和发病因素近年来，随着生活节奏的加快，生活压力的加大，肝郁致病越来越引起医学界的注意许多研究人员为了探讨此证的实质，在其病理生理方面进行了广泛而深入的研究动物模型的复制是动物实验研究成败与否的关键所在科研人员对肝郁证动物模型的复制也作了大量的研究现将近年来有关此证的动物模型研究作一综述 1肝郁模型的造模方法 自1979年湖南医学院首先用艾叶注射液建立了肝郁证模型以来，国内外已相继出现了许多种肝郁模型这些模型主要从两方面入手，一是用过量或毒性药物造成急、慢性中毒损伤来复制模型，二是通过情志刺激改变动物的生理状况来复制模型。
11药物造模法 111艾叶注射法 艾叶性温，味苦平，入脾、肝、肾经现代研究发现，其成分(艾叶油)有拟肾上腺的作用，临床口服大量艾叶可引起中毒性肝炎，还对中枢神经有兴奋作用［１］湖南医学院选用１９～２８?g的小鼠，腹腔注射，用药量为?64?g・kg－１，２?d?1次，用药?４５～６０?d?即出现肝郁症状：小鼠活动增加，兴奋撕打，不易抓到［１］另一种方法是选用大鼠以艾叶注射液?2?mL?腹腔注射，2次/d，半月后改为隔日1次；小鼠以艾叶注射液?06?mL?腹腔注射，1次/d，在注射后?40?d?左右形成肝郁模型［２］ 112肾上腺素皮下注射法 肖纯［３］等取动情期大鼠(180～２００?g)子宫内膜片段移植于卵巢周围或腹壁内侧面，术后４～５?d伤口基本愈合后，以?1g?・Ｌ－１?肾上腺素?015?mL?/只，作皮下注射，每周1次，共4次3周后，肝郁型子宫内膜异位症动物模型即成，模型动物具有中医“肝郁”的临床症状及肾上腺的病理改变此造型方法简便易行，周期短，成活率高 12情志刺激造模法 肝郁证的产生多因消极应激及不良情绪体验所致因此现在许多研究人员认为造模应从病因即情志入手，他们用各种自然激怒法复现“怒伤肝，久则郁”的临床现象来制造肝郁证动物模型。
典型造模法有颈部带枷单笼喂养法、夹尾激怒打斗法和捆绑法 121颈部带枷单笼喂养法(模具法) 陈小野［４，５］选用?180～２２１?g?大鼠为实验对象，将自制的颈部枷锁套在大鼠的脖子上，模具影响大鼠日间理毛、挠痒等活动，从而引起大鼠情志变化7～１０?d?后，造模大鼠反应和行为迟缓，皮毛枯黄，眼睛眯小，有眼眵，甚至目赤，粪便干、少、小，倦怠食少，爪甲紫暗，尾巴呈棕红色，且有鳞片出现 122夹尾激怒打斗法 须惠仁［６］主张用夹尾刺激引发大鼠打斗的方法造模他将雄性Wistar远交系大鼠，体重?３００～４００?g，３～７只同置于一笼中，用尖端以纱布包裹的止血钳夹其中1只大鼠的尾巴，令其与其他大鼠打斗，从而激怒全笼的大鼠每次刺激?30?min，每隔?3?h?刺激1次，每天刺激4次，2?d?后大鼠间剧烈撕打减弱，饮水和吃食也明显减少，甚至不思饮食，多呈困倦状态，毛发变暗、枯黄，体重下降 123捆绑法 吕志平［７］等采用雄性Wistar大鼠，体重为(240±２8)g，用细绷带束缚四肢，使之行走困难，并装入饲养笼内，然后定时观察并记录大鼠状态1周后大鼠出现肝郁表现赵益业［９］等用(20±2)g的昆明小鼠以同样的方法制作肝郁模型。
另外，还可采用双后肢立式束缚激怒的方法造模，此法首次刺激?30min?，以后隔天增加?10?min，共2周［１］ 13药物+情志刺激造模法 此法结合前两种方法，目前采用的有夹尾加肾上腺素注射法具体方法如下：取?150?g?左右的大鼠，用贴有胶布的夹子夹住动物的尾巴，使之保持激怒争斗状态?45?min・d－１，同时每天皮下注射?1?g・L－１?肾上腺素?02?mL/只，造模时间为?30?d［５，９］肝郁造模大鼠随着造模时间的增加，逐渐出现肝郁证的行为学特征：大鼠饮水量增加，容易激惹、咬人，喜欢扎堆、贴边，大便松散而特臭［９］ 2肝郁模型的病理改变 中医认为肝为刚脏，喜条达，恶抑郁，主疏泄肝主疏泄功能主要体现在调畅气机、调节血量、调畅情志、以及调节脾胃升降和女子胞等功能五个方面肝失疏泄会导致这五个方面的失常有学者认为，肝郁证是对抑郁、焦虑、悲痛等负性情绪心理应激状态下，以高级神经中枢调节机制紊乱为前提，神经、内分泌、免疫、循环、消化、感觉、运动等多个系统的某些病理改变、病症表现的有机概括［１０］ 21肝郁模型循环系统的病理改变 肝主疏泄对维持气血条达起重要作用，肝郁则气行不利、血行不畅。
实验研究表明，肝郁能够导致机体微循环障碍和血液流变学的改变吕志平［７］为了揭示“肝郁致瘀”的机理，测定肝郁大鼠模型(捆绑法造模)血浆6-酮-前列腺素Ｆ１α(6-keto-PGF１α)、血栓烷素Ｂ２(ＴＸＢ２)和肝微区、胃微区血细胞灌注量(bloodcellpouringamount,BCPA)结果发现：与正常对照组和逍遥散服药组比较，肝郁大鼠模型血浆TXB２明显升高，６ketoPGF１α明显降低，6ketoPGF１α／ＴＸＢ２比值明显下降(Ｐ＜００1)，肝微区、胃微区ＢＣＰＡ显著减少(Ｐ＜００1)须惠仁［６］等在对肝郁模型组(夹尾法造模)做血液流变学检查中发现：肝郁动物的血小板的含量要比对照组多58%，全血粘度、血浆比粘度明显高于对照组(Ｐ＜００1)，复钙时间比对照组明显延长，其相应的粘度上升率、红细胞比容则明显减少，血沉显著快于对照组(Ｐ＜００1) 22肝郁模型消化系统的病理改变 肝郁则横克脾土，因此肝郁亦会对消化系统造成影响张小丽［１１］研究畅胃胶囊对肝郁症大鼠(夹尾加肾上腺素注射法造模)的治疗作用时，发现肝郁症模型组的大鼠(与空白对照组比较)胃体、胃小弯、胃窦部的浆膜血管均增大、增粗、明显瘀血，胃粘膜有较多的白色苔状物，部分动物有出血点，胃体发红发暗。
邹世洁等［１２］观察慢性萎缩性胃炎模型大鼠(捆绑法造模)的胃肠内分泌情况，发现肝郁胃炎组胰高血糖素含量、胃动素含量降低较其他组明显张沁园［１３］运用酶组织化学技术、电镜技术探讨肝气郁大鼠(捆绑法造模)和肝气逆大鼠的小肠吸收功能，结果证明上述二证型在小肠肌电活动、吸收细胞的酶活性和超微结构三方面均低于正常组(Ｐ＜００1或Ｐ＜００５)，而肝气郁组显著低于肝气逆组(Ｐ＜００５)吕志平等［１４］发现肝郁造模组大鼠(捆绑法造模)肝细胞超微结构较空白对照组明显肿胀，基质减少，线粒体部分溶解，内外膜结构不清，核膜模糊，染色质减少，细胞膜溶合，胞浆内成分严重脱落；肝郁服药组病理改变明显减轻吕志平［１５］还报道肝郁造模组大鼠的肝细胞、血浆丙二醛(MDA)明显高于空白对照组，肝细胞、红细胞超氧化物岐化酶(SOD)活性明显下降，从另一个侧面反映了肝郁大鼠肝细胞的损伤 23肝郁模型免疫系统的病理改变 国外有文献报道，消极应激及不良情绪体验可导致机体细胞免疫、产生抗体及细胞因子功能降低［１６］，说明肝郁证有某些免疫功能的变化国内也有实验证明肝郁对免疫系统造成破坏陈松等［１７］发现肝郁证模型(夹尾加肾上腺素注射法造模)大鼠T、B淋巴细胞转化率显著升高，IgM水平显著降低，认为肝郁证淋巴细胞活性增强。
刘莲等［１８］在实验中发现，肝气郁结证大鼠(模具法造模)免疫器官重量明显减轻；T细胞亚群比例失衡；白细胞介素2水平降低；血浆皮质酮水平明显升高(均为Ｐ＜００1)严灿等［１９，２０］在实验中发现肝郁大鼠(夹尾加肾上腺素注射法造模)的胸腺、脾脏重量较正常对照组明显减轻，腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数降低，肾上腺糖皮质激素水平升高，与正常对照组比较有显著性差别提示肝郁大鼠下丘脑―垂体―肾上腺轴的兴奋性升高，出现免疫抑制状态赵益业［８］发现肝郁造模组动物(捆绑法造模)脾淋巴细胞转化率、溶血素水平低于正常组，白细胞介素2产生能力明显抑制，而逍遥散对其有改善作用从而认为免疫学异常，免疫力低下是肝郁证的重要发病环节 24肝郁模型神经内分泌系统的病理改变 王希浩等［２１］选用有正常性周期的雌性大鼠，采用夹尾刺激法复制肝郁模型结果发现在激怒状态下，大鼠出现性周期紊乱，连续给予刺激的第7天，雌性大鼠血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕激素(P)水平下降，雄激素(T)水平升高，与正常对照组比较，均有显著性差异，提示肝郁雌性大鼠的垂体和卵巢功能显著降低神经递质的测定能够反映机体的植物神经功能，乔明琦等［２２］研究发现肝郁大鼠(模具法造模)下丘脑去甲肾上腺素(NE)显著低于正常对照组，肾上腺素、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)显著高于正常对照组，高香草酸降低，但未达到显著性水平；肝、心、肾、肾上腺器官中上述指标呈现类似改变，认为肝主疏泄与调节单胺类神经递质有关。
毛海燕［２３］观察模具法造模1周和4周的肝郁证大鼠中枢神经递质变化，得出如下结论：造模1周组各脑区5-HT无显著变化，DA含量减少(Ｐ＜００1或Ｐ＜００５)；造模4周组各脑区的5-HT含量与正常对照组比较增多(Ｐ＜００1)，DA含量显著升高(Ｐ＜００1)，经疏肝法治疗后降至正常植物神经系统释放的递质，内分泌腺释放的激素和生物活性物质，都通过细胞内环核苷酸代谢产生生理效应［２４］陆明霞［２５］测定肝郁大鼠神经递质和血浆环核苷酸的含量，显示cAMP下降，cGMP升高，二者比值较正常对照组显著降低，推测肝郁机体存在的植物神经功能紊乱与环核苷酸含量有关 3问题与展望 中医“证”是疾病的病因、病位及病邪性质的概括，且临床多以病人主观感觉反映出来，确切的客观指标尚在探索之中，一些客观表现如舌象、脉象、神志等不易在动物身上模拟出来，因而加大了中医证候模型复制的难度药物造模如艾叶、肾上腺素等均造成了实质性肝脏的急慢性损伤，然而中医肝郁证并不等于肝脏的实质性损伤，同时药物也会影响动物多个器官系统的功能情志造模引起动物心理应激反应，与中医肝郁病因相关，但仍存在三个问题值得深入探讨一是“怒伤肝”与肝郁的关系，怒伤肝会导致肝郁，但同样会导致肝阳上亢；出现何种证型是取决刺激量还是动物品系?二是中医的肝郁并不都产生于怒，所有的情志不畅，郁而不发均可产生肝郁证，如社会压力过大或不得志、伤感又无处倾诉也可产生肝郁证，而临床上多产生于这种情况。
因而这种怒伤肝导致的肝郁模型与临床上出现的肝郁亦存在着一些差别三是上述肝郁模型的表现不尽相同，目前仍无统一的评价标准肝郁证的基本病变是肝失疏泄，从目前掌握的资料分析，肝郁证涉及神经系统、消化系统、内分泌系统、血液循环系统等多系统功能改变在研究这些病理改变时，大多采取情志刺激造模法，各指标的改变与空白对照组比较，有显著性差别或药物反证效果好说明这些病理改变在肝郁证中具有普遍性，但缺乏特异性许多别的证型也存在这些方面的病理改变，如肝郁模型存在微循环障碍，血瘀模型也存在微循环障碍；肝郁模型存在免疫力下降的情况，气虚模型也存在免疫力下降的情况，而血液流变学检查、淋巴细胞的测定等是否能作为肝郁证的特异性检查，这些问题均有待进一步深入研究 笔者认为中医证候动物模型的研究方法当以中医的病因病机理论为准则，既要符合中医的致病因素，又要符合临床自然发病的实际过程我们应采取多种复合方法，模拟中医情志因素，不断。