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1、三七皂甙单体Rg1对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体功能影响的研究_临床医学论文 作者：李伟文，方传勤，陆松敏，刘建仓，郭素清，程凤，王正国【摘要】 目的 观察三七皂甙单体Rg1对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体细胞色素氧化酶（COX）活性及膜电位的影响。方法 健康Wistar大鼠24只，随机等分为4组：正常对照组(N)、失血性休克5小时组(HS)、单纯复苏对照组(RE)、复苏加Rg1 治疗 组(Rg)，每组6只。采用荧光分光光度法检测线粒体膜电位;采用紫外分光光度法检测COX活性。结果 失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体摄取Rhodamine123减少，即膜电位水平显著降低（P0.01），单纯
2、复苏组膜电位有轻微提高,复苏加Rg1治疗组线粒体膜电位明显提高,恢复到正常组水平。失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性显著降低，单纯复苏后其活性仍然较低。复苏加Rg1治疗组COX活性较休克组比较有明显升高，并显著高于单纯复苏组。结论 复苏加Rg1可显著提高失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性及线粒体膜电位。Rg1提高COX活性可能和提高该酶的产量和质量有关。 【关键词】 失血性休克；肠上皮细胞；三七皂甙单体Rg1；细胞色素氧化酶；线粒体膜电位【Abstract】 Objective To study the effects of Rg1 isolated from panax n
3、otoginseng saponins(PNS) on mitochondrial cytochrome oxidase(COX) and membrane potential of small intestinal epithelial cells in hemorrhagic shock rats.Methods Twentyfour healthy Wistar rats were divided into 4 groups: control group(n=6),5 hour hemorrhagic shock group(n=6),simple resuscitation group
4、(n=6),and resuscitation plus Rg1 treatment group(n=6).COX activity was determined by ultraviolet spectrophotometer,and mitochondrial membrane potential(MMP) by fluorospectrophotometry.Results The COX activity was lowered markedly in hemorrhagic shock group compared with the control group(P0.01),and
5、increased more remarkably after treatment by PNS Rg1 compared with the shock group and the resuscitation group(P0.01).The mitochondrial membrane potential(MMP) was lowered more markedly in 5 hour hemorrhagic shock group compared with the control group(P0.01),and increased more markedly after treatme
6、nt by PNS Rg1 and then came back to normal level.The MMP increased higher in resuscitation group compared with the shock group(P0.01).Conclusion The mitochondrial COX activity and membrane potential can be increased markedly after treatment by PNS Rg1 compared with the hemorrhagic shock group. PNS R
7、g1 may improve COX activity by increasing its production and quality.【Key words】hemorrhagic shock;intestinal epithelial cells；panax notoginseng saponins Rg1；cytochrome oxidase；mitochondrial membrane potential 能量代谢障碍，线粒体损伤是休克的重要成因。失血性休克后缺血低氧能使线粒体 电子 传递链上细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）活性显著降低,线粒体呼吸功能也进
8、行性下降。三七皂甙单体Rg1能显著提高失血性休克大鼠的存活率，使受损线粒体功能形态明显恢复，并能上调COX和COX基因的表达1。本实验观察Rg1对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性及膜电位的影响，为Rg1在失血性休克时保护线粒体的作用机制及缺血低氧性线粒体损伤的防治药物的研究提供理论基础。 材料与方法 1 动物分组与模型制作2健康Wistar大鼠24只，体重（25020）g,由第三军医大学野战外科研究所动物实验中心提供。随机等分为4组：正常对照组(N)、失血性休克5小时组(HS)、单纯复苏对照组(RE)、复苏加Rg1治疗组(Rg)，每组6只。RE组于失血性休克低血压维持40mmHg 2小
9、时后，静脉给二倍失血量的平衡盐液；Rg组于失血性休克低血压维持40mmHg 2小时后，静脉给二倍失血量的平衡盐液和Rg1（5mg/kg，体重），继续观察3小时。N组除不放血外,其余处理同休克组。 2 主要仪器和试剂配制 2.1 主要仪器F4500荧光分光光度计（HITACHI），产地日本；组织研磨器（90MM），产地涿州。2.2 主要试剂及其配制肠上皮细胞线粒体分离液：临用前配制，取蔗糖85.575g,Tris 1.2114g,EGTA（ethyleneglycolbisN,Ntetraacetic acid）0.7608g溶于900ml水中，调节pH值至7.6,定容至1 000ml，保存于4
10、。肠上皮细胞线粒体反应递质（225mmol/L蔗糖，20mmol/L KCl， 5mmol/L MgCl2，10mmol/L K2HPO4/KH2PO4，10mmol/L TrisHCl，1mmol/L EGTA，pH7.4）；称取0.7701g蔗糖、0.1864g KCl、0.0474g MgCl2、0.1576g TrisHCl、0.2282g K2HPO4、0.136g KH2PO4、0.0380g EGTA、0.1g BSA,加双蒸水（ddH2O）溶解，调pH7.5,定容至100ml,保存于4。临用时加入鱼藤酮,使其浓度为5mol/L，加入琥珀酸钠,使其浓度为5mmol/L。鱼藤酮、琥
11、珀酸钠、细胞色素C及罗丹明123（Rhodamine 123）购自Sigma公司。 3 线粒体制备按 文献 所述方法并改进。用差速离心法获得线粒体。将线粒体悬浮在1.5ml分离递质中,卡马氏兰法测定蛋白含量,使蛋白浓度为5mg/ml，用来测量线粒体膜电位；再将线粒体蛋白浓度调整为1mg/ml测量COX活性。以上操作均在04，2小时内完成。 4 线粒体膜电位的检测根据文献2略有改进，以阳离子荧光染料Rhodamine123为探针，通过线粒体摄取Rhodamine123后所引起递质中荧光值的变化来反映线粒体膜电位。步骤如下：肠黏膜细胞所分离的新鲜线粒体用Bradford法定蛋白(以BSA为参照)，
12、 用线粒体反应递质调整线粒体蛋白浓度约5mg/ml。2ml线粒体反应递质中加入0.5nmol/L Rhodamine123，用F4500荧光分光光度计(激发波长500nm，发射波长525nm)测量荧光基准值(F1)，再加入100l线粒体悬液，25孵育15分钟，5000g离心10分钟，取上清测量其荧光值(F2)，以F=(F1-F2)线粒体蛋白量(mg)-1来 计算 每mg线粒体蛋白引起的荧光变化。 5 细胞色素氧化酶(COX)活性测定3取0.18mmol/L细胞色素C 0.5ml，加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)和过硫酸钠（Na2S2O4）摇匀，用分光光度计在550nm波长下测得A值，然后
13、加入线粒体悬液0.1ml(含蛋白0.1mg)，立即开始计时，随后每隔1分钟测定1次A值，持续测定5分钟，最后加入饱和高铁氰化钾溶液1滴，使之完全氧化并记录结果。以最小二乘法计算，并经原点线求其斜率(K)值，即为细胞色素C氧化速率常数，代表COX的活性(mol/min/mg Mt.Pro)。 6 统计学处理各组数据用均数标准差(s)表示，采用t检验和单因素方差分析检验各资料的统计学显著性差异，P0.05为差异显著,P0.01为差异非常显著。用SPSS 10.0统计分析软件进行数据处理。 结果 1 各组大鼠肠上皮细胞线粒体膜电位的的改变扫描电镜观察显示，差速离心法获得悬液中主要成分是线粒体。线粒体
14、为圆形或椭圆形，有较完整的膜性结构，嵴排列整齐、致密(见图1)。失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体摄取Rhodamine123减少，即膜电位水平显著降低（P0.01），单纯复苏组膜电位有轻微提高,复苏加Rg1 治疗 组线粒体膜电位明显提高,恢复到正常组水平(见表1) 。表1 各组大鼠肠上皮细胞线粒体摄取Rhodamine123的变化(略) 2 各组肠上皮细胞线粒体COX活性的比较失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性显著降低，单纯复苏后其活性仍然很低。 复苏加Rg1治疗组COX活性较休克组比较有明显升高，并显著高于单纯复苏组。 讨论组织细胞缺血低氧时，线粒体呼吸、渗透压调节以及钙转运
15、等功能受到影响，细胞色素C氧化酶活力显著降低。休克缺血低氧所致酸中毒也可促进线粒体膜通透性增高及离子转运功能紊乱，从而也影响了线粒体正常膜电位的维持4。本实验主要研究Rg1对失血性休克时大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性及膜电位的影响。 1 Rg1对失血性休克肠上皮细胞线粒体COX活性的影响及其调节机制COX是由线粒体基因组与核基因组各自编码的亚基共同组成的复合物，是呼吸酶系中的关键酶，其酶活性变化直接影响整个呼吸链的功能变化。同时COX又是最不稳定、最易受损的酶，尤其易受自由基氧化损伤，引起 电子 传递过程中电子漏失，电子传递效率下降。早期的研究发现COX活性下降与失血性休克后缺血低氧性细胞损伤有关5，6。本实验观察到，随着休克时间延长，大鼠肠上皮细胞缺血低氧加重， COX活性会逐渐下降，影响整条呼吸链功能，使三磷酸腺苷（ATP）合成减少。大鼠失血性休克5小时肠上皮细胞线粒体COX活性显著低于正常对照组，说明缺血低氧可影响线粒体内膜呼吸链的电子传递速率，降低线粒体利用氧的能力。复苏加Rg1可显著提高COX活性，可使其活性维持在较高水平。Burke和Poyton7对低等真核生物酵母的研究认为，缺血低氧可能通过两种途径影响酶活性：（1）长期调节，即缺血低氧可通过影响基因的表达，导致有活性的酶分子数的改变。本实验研究也观察到失血性休克5小时组，COX
