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1、型神经纤维瘤病软骨细胞生物学特性的研究_临床医学论文 作者：陈晖，邱勇，王斌，俞扬，朱泽章，朱锋，钱邦平，马薇薇 【摘要】 目的 检测神经纤维瘤蛋白在型神经纤维瘤病(type 1 neurofibromatosis，NF1)脊柱侧凸患者软骨细胞中的表达，观察NF1脊柱侧凸患者软骨细胞的生物学特性。方法 先天性脊柱侧凸患者7 例，NF1脊柱侧凸患者6 例，两组年龄和Cobb角接近。脊柱后路手术中取髂骨生长板行软骨细胞分离和培养。取第2代软骨细胞分别检测其增殖活性和型胶原、可聚蛋白多糖等软骨细胞特异性分化指标，并用免疫沉淀和Western blot检测神经纤维瘤蛋白在两组软骨细胞中的表达。结果 N
2、F1脊柱侧凸患者软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达水平明显低于先天性脊柱侧凸组(灰度积分比值分别为1.310.53和2.171.02，P0.03)，其型胶原水平明显低于先天性脊柱侧凸患者组(26.611.3 ng/mgpro 和31.716.2 ng/mgpro，P0.03)，而可聚蛋白多糖水平两组无明显差异(63.0129.6 ng/mgpro和76.7519.4 ng/mgpro，P0.21)。NF1脊柱侧凸患者软骨细胞显示相对活跃的增殖活性(增殖倍数分别为2.90.04和2.490.11，P0.02)。结论 NF1脊柱侧凸患者软骨细胞神经纤维瘤蛋白表达降低的同时，其细胞增值相对活跃，细胞分化功
3、能也存在缺陷。 【关键词】 神经纤维瘤病 脊柱侧凸 神经纤维瘤蛋白 软骨细胞 生物学特性Biological Features of Chondrocytes Isolated from Patients with Type NeurofibromatosisAbstract：Objective To detect the neurofibromin expression and observe the biological features of the chondrocytes of patients with type neurofibromatosis(NF1) and scolios
4、is.Methods 7 cases of congenital scoliosis and 6 cases of NF1 scoliosis were chosen with the similar age and Cobb angle.The growth plate was harvested from the ilia，diced and sequentially digested with enzymes.Proliferation of the chondrocytes，and also the specific differentiation indice including t
5、ype collagen and aggrecan were assayed.Neurofibromin expression in the two kinds of chondrocytes was detected with immunoprecipitation followed by Western blot.Results Compared to the chondrocytes of patients with congenital scoliosis，lower level of neurofibromin was expressed in chondrocytes of pat
6、ients with NF1 scoliosis(the OD value was 1.310.53 and 2.171.02 respectively，P0.03).The level of type collagen was lower in chondrocytes of patients with NF1 scoliosis(26.611.3 ng/mgpro vs 31.716.2 ng/mgpro，P0.03)，but the level of aggrecan does not differ between the two groups(63.0129.6 ng/mgpro和76
7、.7519.4 ng/mgpro，P0.21).The proliferation rate of the NF1 chondrocytes was higher(2.90.04 and 2.490.11，P0.02).Conclusion With the decrease of neurofibromin expression，the NF1 chondrocytes show higher proliferation rate，and there is also functional deficiency in cell differentiation.Key words：neurofi
8、bromatosis；scoliosis；neurofibromin；chondrocytes；biological feature脊柱侧凸是型神经纤维瘤病(type 1 neurofibromatosis，NF1)患者的特征性表现之一，发病率高达20左右1，该类型脊柱侧凸由于其骨骼营养不良性改变和术后假关节发生率高等使 治疗 非常困难。NF1是一种常染色体显性遗传疾病，其典型特征是皮肤咖啡牛奶斑和神经纤维瘤。近年来研究发现，型神经纤维瘤病上述表型可能与神经纤维瘤蛋白功能缺失导致的相关类型细胞功能缺陷有关24。目前神经纤维瘤蛋白在人软骨细胞中是否表达和NF1患者软骨细胞是否同样存在功能缺陷尚未
9、见报道。本研究在检测NF1软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达的同时，拟对体外NF1软骨细胞的生物学行为进行观察。 1 材料与方法 1.1 临床资料收集两组病例，第1组7 例为先天性脊柱侧凸，均经影像学资料证实有半椎体或椎体分节不良，男2 例，女5 例；年龄712 岁，平均8.5 岁。Cobb角为65110，平均84。第2组6 例为NF1脊柱侧凸，均符合NIH临床诊断标准5，男4 例，女2 例；年龄814 岁，平均10.6 岁；Cobb角62116，平均87。第2组6 例患者均为营养不良性脊柱侧凸。所有病例均排除代谢性骨病及激素、抗凝药等药物应用史，骨盆正位片显示双侧髂骨无异常。1.2 软骨细胞培养本
10、文采用酶消化法进行软骨细胞分离。脊柱后路手术中取髂骨生长板约0.51.0 g，在加入少量培养液的无菌培养皿中仔细修整软骨，去除软骨膜和骨组织，将软骨块剪切成直径1 mm左右软骨颗粒。转入无菌的100 mL锥形瓶，0.1M PBS反复冲洗3次，用10倍体积的下列酶溶液依次进行消化，其中0.05透明质酸酶消化5 min，0.25胰酶/0.02EDTA消化30 min，0.2型胶原酶消化23 h，37水浴振荡，每次消化后以0.1M PBS洗涤。至软骨颗粒成絮状时停止消化，200目细胞筛过滤，滤液离心1 000 rpm10 min，培养液洗涤3次。胎盘蓝染色和细胞计数板计数，3104/cm2密度接种于
11、75 cm2或25 cm2培养皿。每周换液2次，细胞接近融合时0.25胰酶/0.02EDTA消化并按13传代。培养液成分：DMEM/F12 11(Hyclone)，10胎牛血清(FBS，Hyclone同批次血清)，青霉素100 U/mL(Sigma)，链霉素100 g/mL(Sigma)。细胞培养至第2代进行检测，检测前制备细胞爬片，甲苯胺蓝染色。1.3 细胞增殖活性检测(MTT法)软骨细胞以每孔5103个细胞接种于96孔板，每孔100 L培养液，每组设6个复孔，分别于第1、3、5、7、9天观察。第3天和第6天换液，检测当日每孔加入10 L MTT溶液(5 mg/mL)，放置CO2孵箱孵育4
12、h，弃上清后加入100 L DMSO，混匀仪震荡3 min，酶标仪(Sunrise)570 nm波长检测光密度(optical density，OD)值。根据所测OD值 计算 最终增殖倍数(第9天OD值除以第1天 OD值)。1.4 软骨细胞分化指标检测1.4.1 型胶原含量以每孔4104个细胞接种于24孔板，每孔0.5 mL，每组3个复孔，10FBS培养2 d后换2FBS培养4 d。型胶原主要存在于细胞外基质，检测前需要进行基质消化。每孔加入0.5 mL 0.05 M乙酸(甲酸调至pH2.83.0)，细胞铲刮下细胞后转移至1.5 mL Eppendorf管。分别用胃蛋白酶(10 mg/mL溶于
13、0.05 mol/L乙酸，pH2.83.0)和胰弹性蛋白酶(1 mg/mL溶于1TSB，pH7.88.0)4C消化，旋转混匀仪过夜，室温10 000 rpm离心5 min，上清液70C保存待用。型胶原检测采用EIA试剂盒(Chondrex)，490 nm波长测量OD值。改良Lowry法蛋白浓度测定，用每孔蛋白浓度进行胶原含量标准化。1.4.2 可聚蛋白多糖水平以每孔4104个细胞接种于24孔板，每孔0.5 mL，每组3个复孔，10FBS培养2 d后换2FBS培养，第4天取上清70C保存待用。检测采用可聚蛋白多糖EIA试剂盒(Biosouce)，450 nm波长测量OD值。改良Lowry法蛋白浓
14、度测定，用每孔蛋白浓度进行胶原含量标准化。1.5 神经纤维瘤蛋白水平由于直接应用Western blot检测软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达非常困难，本文先用免疫沉淀方法纯化并浓缩该蛋白，然后再以Western blot检测。取3106个软骨细胞，冷PBS洗涤后加入200 L RIPA缓冲液(790 mg TrisHCl和900 mg NaCl溶于75 mL去离子水，PH值7.5，10 mL 10 NP40，2.5 mL 10去氧胆酸钠，1 mL 0.1 mol/L EDTA，76.1 mg 2 mmol/L EGTA，临用前取1 mL RIPA裂解缓冲液加入蛋白酶抑制剂5 L)，50(v/v)蛋
15、白A琼脂糖凝胶预处理，改良Lowry法测定蛋白浓度。等量总蛋白中加入2 g神经纤维瘤蛋白多抗(Novus)，4C过夜，加入50 L蛋白A琼脂糖凝胶，4C过夜，离心、洗涤免疫沉淀产物，十二烷基硫酸钠上样缓冲液溶解沉淀，煮沸后进行7SDSPAGE电泳。湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上4C过夜，5脱脂奶粉封闭，加入神经纤维瘤蛋白单抗(Zymed，11000)，4C孵育过夜，二抗常温下孵育3 h，ECL化学发光法检测。胶片用TotalLab 2.0图像分析软件进行分析，所测各条带灰度值和NF1中条带1的灰度值比较得出相对比值。1.6 统计学方法所有数据用SPSS 10.0处理并进行结果分析，组间差异比较使用独立样本t检验。 2 结果 2.1 软骨细胞培养本文中软骨细胞原代培养时间约45周，可获得1.51062.0106个细胞，胎盘蓝染色细胞存活率约85。细胞按13传代，传代后约14 d细胞接近融合。倒置显微镜下软骨细胞呈椭圆形、锥形或不规则多边形，可见典型的铺路石样改变。细胞爬片甲苯胺蓝染色阳性。2.2 软骨细胞增殖活性细胞培养第9天NF1脊柱侧凸患者软骨细胞和先天性脊柱侧凸患者软骨细胞增殖倍数分别为2.90.04和2.490.11(P0.02，见图1)。该体外培养的结果显示，与先天性脊柱侧凸患者软骨细胞相比，NF1脊柱侧凸患
