棉花应答逆境胁迫的蛋白质组学研究进展 吴巧娟++徐剑文++刘剑光++赵君 肖松华++袁有禄Reference：蛋白质组学是近年来随着人类基因组计划完成而逐步兴起的生命科学领域的又一研究热点本文系统综述了棉花盐碱胁迫、低温胁迫、干旱胁迫和病害胁迫的蛋白质组学研究进展，并对利用蛋白质组学深入研究棉花与各种逆境互作的分子机制进行展望Keys：棉花；逆境胁迫；分子机制；应答；蛋白质组学；研究进展S562.01；Q785： A[HK]：1002-1302（2016）12-0022-02[HS）][HT9.SS]收稿日期：2015-11-10基金项目：[JP2]棉花生物学国家重点实验室开放课题（编号：CB2014A16）作者简介：吴巧娟（1978—），女，浙江浦江人，硕士，从事棉花资源创新利用研究E-mail：[email protected]通信作者：肖松华，研究员E-mail：[email protected]棉花是世界主要的经济作物和天然纤维作物，也是研究植物纤维发育最为理想的模式作物，同时又具有较强的耐盐性，是改良盐碱地较为理想的先锋作物蛋白质组学是近年来随着人类基因组计划完成而逐步兴起的生命科学领域又一研究热点。
蛋白质组（proteome）的概念最先由MarcWilkins提出，是指由一个基因组（genome）或一个细胞、组织表达的所有蛋白质（protein）[1]近年来，许多学者相继开展棉花基因组学、转录组学、蛋白質组学等方面的研究，并取得了一些进展本文较为系统地回顾了棉花逆境胁迫应答的蛋白质组学研究进展，为利用蛋白质组学技术深入研究棉花应对逆境胁迫的分子机理奠定了理论基础1逆境胁迫的蛋白质组学研究植物在生长发育过程中，经常会遭受病菌、害虫等生物胁迫和低温、干旱和盐碱等非生物胁迫由于这些不良环境条件对植物生长发育或繁殖产生负面影响，因此植物自身在遭遇、适应这些胁迫过程中产生一系列应答反应，并引起多个相关通路的蛋白发生种类和表达量变化1.1棉花高盐胁迫的蛋白质组学研究盐胁迫与植物生理和代谢密切相关，是影响植物生长发育最主要的非生物胁迫之一然而，目前世界上约20%的耕地和50%的灌溉地正在遭受盐分的影响，土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题棉花具有较强的耐盐性，其中非洲棉和海岛棉的耐盐性优于陆地棉和亚洲棉近年来，国内外研究者利用蛋白质组学围绕棉花耐盐机理等方面开展了大量研究，并取得了很大进展。
双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技术是目前较为常用的分离蛋白质的重要技术，研究者利用双向电泳技术对棉纤维发育机理进行探索[2-4]，确定“-3 DPA”是纤维起始发育的开始，并发现了众多与棉纤维发育相关的蛋白质当前，也有研究者利用双向电泳技术分离棉花耐盐相关蛋白质的报道[5-9]研究者主要围绕棉花叶片蛋白质组双向电泳的技术条件进行优化，并分离到涉及光呼吸、细胞防御以及氨基酸代谢等信号途径中的蛋白质同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ） 技术可以利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术周仲华等基于iTRAQ技术，针对采用漂浮育苗、传统营养钵育苗分别进行鉴定、比较分析，确定枯草杆菌酶家族蛋白（subtilase family protein）、α/β水解酶（alpha/beta-Hydrolases）、超家族蛋白（superfamily protein）等6个与棉花水浮育苗适应性高度相关的棉花耐涝渍关键基因。
而王丽等同样利用iTRAQ技术鉴定出169个与棉花苗期与水分胁迫相关的差异蛋白，且发现磷酸果糖激酶（phosphofructokinase1）等糖酵解途径中的蛋白在漂浮育苗根系中比营养钵育苗根系中表达量更高[10]许菲菲也运用iTRAQ技术对NaCl不同胁迫时期下蛋白质的差异进行了研究，结果鉴定出121个差异蛋白，并发现盐敏感品系“被动”抵抗盐胁迫，而耐盐品系则通过信号转导以及清除活性氧“主动”抵抗盐胁迫伤害，有助于进一步揭示棉花耐盐分子机制[11]1.2棉花低温胁迫的蛋白质组学研究植物响应低温胁迫是一个复杂的网络调控反应，众多低温响应蛋白在此网络途径中起重要作用目前，也有许多有关运用蛋白质组学技术研究棉花低温胁迫的分子机制的研究报道[12-14]邰付菊等对5日苗龄的棉花于4 ℃下处理12 h，利用2-DE技术得到49个显著差异的蛋白点，其中低温处理后上调的有27个，减弱表达的有22个[12]李锐等则对耐低温能力强的品种锦3047和不耐低温的品种410进行了蛋白质组比较分析，发现锦3047的50个蛋白点在低温胁迫前后的表达量有明显差异，其中19个蛋白质在锦3047中表达丰度增大，并明显高于品种410，11个蛋白点表达丰度变小，且低于品种410[14]。
对入选的锦3047的差异蛋白点进行质谱分析、鉴定，得到30个蛋白的完整肽指纹图谱，其中逆境蛋白占20%以上研究为今后研究棉花耐低温分子机制提供了良好的研究基础，同时也可以看出更加深入具体的研究工作尚需要积极开展1.3棉花干旱胁迫的蛋白质组学研究随着全球气候变暖，旱灾时有发生干旱已经严重影响我国的棉花生产因此，也有研究者采用蛋白质组学方法，鉴定干旱胁迫蛋白，研究棉花耐旱机制[6，15-17]陆许可等运用2-DE技术对抗旱品种中H177和不抗旱品种中S9612为材料进行蛋白质组分差异分析，结果发现，在干旱胁迫下，这2个品种棉花叶片蛋白表达差异较大，并通过质谱分析鉴定出43个差异蛋白，进一步功能分类分析表明干旱胁迫蛋白参与光合作用、物质与能力代谢、抗逆相关蛋白、物质运输和活性氧清除；Rubisco活化酶和能量代谢相关蛋白ATP合成酶类表达差异最大[16]郭忠军则对PEG处理苗期的棉花叶片进行蛋白质组分析，鉴定得到102个蛋白点，经功能分类分析发现，它们除参与上述相关途径外，还与氨基酸和蛋白质合成、细胞加工以及分子伴侣等过程有关[6]以上研究结果对探讨了解棉花抗旱机理进而指导棉花抗旱育种等方面都具有极其重要的意义。
1.4病菌胁迫的蛋白质组学研究黄萎病（Verticillium dahliae）是棉花主要病害之一，严重影响我国各地棉花产量近年来，也有诸多研究工作者利用蛋白质组学手段对棉花黄萎病的侵染机制等方面展开研究的报道[18-21]王雪等研究发现，大量新的蛋白质在黄萎病病菌胁迫下在棉花叶片中被诱导产生，由此推测DEAD/H-box RNA解旋酶（helicase）、丝氨酸蛋白酶抑制剂和ODR-3蛋白可能参与棉花对黄萎病的抗性反应[18]Xie等则发现黄萎病病菌侵染棉花后，棉花首先建立了早期的与活性氧（reactive oxygen species，ROS）、细胞死亡等蛋白质有关的防御反应，同时黄萎病毒素通过调控宿主蛋白质的合成来诱导植物细胞死亡，并且快速诱导老叶片细胞死亡[19-20]此外，也有研究者从代谢角度分析阐述了棉花和黄萎病病菌之间的互作机制如高巍利用2-DE方法获得了188个在黄萎病菌侵染海7124根系中差异表达的蛋白，分类分析结果表明大多数蛋白与细胞工程、代谢过程和应激反应有关，说明病菌侵染后正常情况下的细胞过程和生理代谢都发生了很大变化；进而他们针对蛋白表达谱中发现的2个与棉酚代谢相关的酶进行了功能研究，证明棉酚可能影响棉花对黄萎病病菌的抗性[21]。
棉花根黑腐病也是目前生产上造成棉花植株死亡的主要病害之一Coumans等利用2-DE技术针对棉花根黑腐病病菌（Thielaviopsis basicola）侵染机制进行研究，发现了包括致病蛋白和活性氧等防御和胁迫有关的蛋白、糖和氮代谢以及类异戊二烯合成等有关的蛋白[22]2前景与展望除上述研究报道外，也有学者对棉花在NO等胁迫下蛋白质组学进行研究[23]总而言之，随着棉花基因组测序的完成以及蛋白质组学技术在棉花逆境胁迫中的广泛应用，不仅有利于解析棉花应答各种逆境胁迫的分子机制，而且还对棉花抗逆品种培育等工作产生深远影响尽管目前研究者利用蛋白组学技术已经获得了大量有关棉花抗逆的信号途径和蛋白信息，但目前尚未明确这些细胞代谢途径以及各种防御蛋白如何参加棉花应对逆境胁迫的分子机制相信在基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及表观遗传学等多学科综合信息指导下，棉花应对各种逆境胁迫的分子机理逐步被揭示，必将迎来棉花后基因组时代的蓬勃发展，推动棉花抗逆境调控网络的遗传解析和抗逆境新品种的创制[HS2][HT8.5H]Reference：[HT8.SS][1][ZK（#]朱小燕. 蛋白质组学及其在植物生态毒理学研究中的应用.2008[J]. 淮阴工学院学报，2008，17（1）：68-71.[2]Graves D A，Stewart J M. Analysis of the protein constituency of developing cotton fibers[J]. J Exp Bot，1988，39：59-69.[3]Ferguson D L，Turley R B，Triplett B A，et al. Comparison of protein profiles during cotton（Gossypium hirsutum L.） fiber cell wall development with partial sequences of two proteins[J]. J Agr Food Chem，1996，44：4022-4027.[4]Yao Y，Yang Y W，Liu J Y. An efficient protein preparation for proteomic analysis of developing cotton fibers by 2-DE[J]. Electrophoresis，2006，27（22）：4559-4569.[5]徐子剑，舒骁，杨亦玮，等. 棉花纤维蛋白质3种提取及二维电泳方法的比较[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2006，22（1）：77-80.[6]郭忠军. 干旱胁迫下棉花蛋白质组双向电泳体系构建与差异表达蛋白功能分析[Z]，2012.[7]韩吉春，崔海峰，时鹏涛，等. 棉花叶片双向电泳体系的研究[J]. 棉花学报，2012，24（1）：27-34.[8]孙峰，王云生. 盐协迫下AM菌侵染的棉花幼苗根系蛋白质组分析[J]. 核农学报，2012，26（1）：170-175.[9]Cui Y P，Lu X K，Wang D L，et al. Comparative analysis of salinity-induced proteomic changes in cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Agricultural Sciences，2015，6（1）：78-86.[10][ZK（#] 王丽，周仲华，郑顺利，等. 基于定量蛋白质组学的棉花耐涝渍基因初步鉴定[J]. 棉花學报，2014，26（4）：283-289.[11]许菲菲. 棉花苗期叶片盐胁迫差异蛋白质分析[D]. 北京：中国农业科学院，2014.[12]邰付菊，李扬，陈良，等. 低温胁迫下棉花子叶蛋白质差异表达的双向电泳分析[J]. 华中师范大学学报：自然科学版，2008，42（2）：262-266.[13]盖英萍. 棉花、烟草响应低温胁迫的差异蛋白质组学研究[D]. 泰安：山东农业大学，2008.[14]李。