小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail 1表达的抑制作用临床医学论文

小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail 1表达的抑制作用_临床医学论文 作者：方开云 石明隽 肖 瑛 桂华珍 郭兵 张国忠【摘要】 目的： 观察小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用及意义方法： 将原代培养肾小管上皮细胞分为5组，（1）对照组（含糖5.5 mmol/L）；（2）高糖组（含糖25 mmol/L）；（3）Snail1 siRNA处理组，转染Snail1 siRNA，6 h后更换为高糖（含糖25 mmol/L）培养；（4）Control siRNA处理组，转染Control siRNA作为阴性对照，6 h后换为高糖（含糖25 mmol/L）培养；（5）高渗组(含甘露醇19.5 mmol/L)72 h后收集细胞，用Western blot检测Snail 1、Vimentin蛋白表达，用半定量RTPCR检测Snail 1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP1）和纤维连接蛋白（FN）的mRNA表达结果： 肾小管上皮细胞转染Snail1 siRNA后，与高糖组比较Snail1 mRNA和蛋白表达分别下降62%和68%（P<0.01）；与高糖组比较，Snail1 siRNA处理组Vimentin、FSP1、FN蛋白和（或）mRNA表达显著下调（P<0.01）。

结论： (1)小干扰RNA 能显著抑制高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达；(2)Snail1参与了高糖作用下肾小管上皮细胞病理改变，并在细胞外基质的沉积中起重要作用 【关键词】 RNA 小干扰 上皮细胞 肾小管 snail 1 波形蛋白 蛋白质类 大鼠 SpragueDawleySnail 1属于锌指转录因子Snail超家族成员，研究显示该基因在正常胚胎发育和肿瘤的浸润、转移机制中有重要作用[1，2]报道认为Snail 1参与腹膜纤维化[3]和单侧输尿管梗阻肾脏纤维化[4]的发生本实验前期研究发现，Snail 1蛋白在糖尿病大鼠肾小管高表达，用胰岛素将糖尿病大鼠血糖控制到正常水平后，Snail 1蛋白的表达明显减少，表明糖尿病状态促进了肾脏Snail 1的表达；并且胰岛素 治疗 组大鼠在肾脏Snail 1表达回降的同时，肾功能及肾脏病理改变逐渐改善，提示Snail 1与糖尿病肾病（diabetic nephnopathy,DN）的发生、 发展 有关[5～6]为进一步证实这一推测，2007年7月应用小RNA干扰技术，通过特异性的Snail 1 siRNA转染原代培养肾小管上皮细胞，观察高糖刺激下Snail 1表达的变化及意义。

1 材料和方法 1.1 材料1.1.1 动物 雄性SD鼠，体重（100～120）g，由贵阳医学院实验动物中心提供1.1.2 主要试剂 DMEM（含糖5.5mol/L）、胎牛血清（HyClone），胰蛋白酶、EDTA（Sigma）；羊抗大鼠Snail 1多克隆抗体（SC10432）、驴抗羊lgGHRP、TBS Blotto A Blocking Reagent、Snail 1 siRNA（SC38399）、siRNA Transfection Reagent（sc29528）、siRNA Transfection Medium（sc36868）、siRNA Dilution Buffer（sc29527）、Fluorescein Conjugated Control siRNA（sc36869）（Santa Cruz）；抗波形蛋白（vimentin）抗体，抗βactin抗体、SABC，DAB试剂盒(武汉博士德)EZ Spin Column RNA Purification Kit（BBI）、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）、Snail1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblastspecific protein1, FSP1）、FN和βactin PCR引物为上海生物工程有限公司提供。

1.2 方法1.2.1 肾小管上皮细胞的原代培养 采用大鼠原代肾小管上皮细胞培养方法[7]，取初代细胞为实验所用1.2.2 细胞分组、转染 初代细胞按2×105/孔接种于6孔板中，用不含抗生素的培养基（DMEM+20%FCS）培养24 h后，分为：（1）对照组，用DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（2）高糖组，用19.5 mmol/L Dglucose+DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（3）Snail1 siRNA处理组，按操作说明转染Snail1 siRNA，6 h后换为19.5 mmol/L Dglucose+DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（4）Control siRNA处理组，转染Control siRNA作为siRNA阴性对照，6 h后换为19.5 mmol/L Dglucose+DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（5）高渗组，用19.5 mmol/L DMannitol+DMEM（含糖 5.5mmol/L）+2%FCS培养，72 h后收集细胞每个实验组设3个复孔，重复3次实验贵阳医学院学报 34卷 2期方开云等 小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail 1表达的抑制作用1.2.3 Western Blot 106个细胞加裂解液200 μl，4 ℃，裂解30 min，离心取上清液测定蛋白含量，经SDSPAGE垂直凝胶电泳后，电转移至PVDF膜。

5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜后分别加抗Snail 1（1∶200）和Vimentin(1∶300)抗体，4 ℃孵育过夜；加相应二抗室温孵育2 h，ECL试剂曝光显影用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与βactin抗体（1∶500）孵育凝胶成像系统进行图像分析，以βactin蛋白条带作内参照，结果用靶蛋白/βactin比值表示1.2.4 半定量RTPCR 按照试剂盒说明提取细胞总RNA,并逆转录成cDNA，PCR引物序列见表1PCR反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,退火30 s,72 ℃延伸45 s,40个循环后充分延伸10 minPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统分析， 计算 待测指标与内参βactin灰度比值1.3 统计学分析实验结果以x±s表示，用SPSS 11.5统计软件处理组间比较采用方差齐性检验，单因素方差分析，P<0.05认为差异有显著性2 结 果 2.1 荧光显微镜下观察 表1 PCR引物序列及扩增条件对照组未检测到Snail 1蛋白表达，Snail 1 mRNA有微量表达，高糖组两者表达均较对照组显著增高（P<0.01）。

肾小管上皮细胞转染Snail 1 siRNA后，与未转染高糖组比较，其Snail 1 mRNA（图2A）和蛋白（图2B）表达水平分别下降62%和68%（P<0.01）Control siRNA不影响Snail1表达水平2.3 Vimentin mRNA和蛋白表达结果表明，高糖显著上调Vimentin mRNA和蛋白的表达，高渗组与对照组相比，差异无显著性，说明高糖上调肾小管上皮细胞vimentin mRNA和蛋白的表达并不依赖于细胞所处的注：1.对照组，2.高糖组，3.Snail 1 siRNA处理组，4.Control siRNA处理组，5.高渗组；（1）与对照组比较，P＜0.01;(2)与高糖组比较，P＜0.01epithelial cells after the transfe ction of smail 1 siRNA高渗环境；而转染Snail1 siRNA后显著下调高糖诱导的vimentin mRNA和蛋白表达，分别达59%和58%Control siRNA不影响高糖诱导的vimentin mRNA表达和蛋白表达，见图32.4 FN和FSP1mRNA表达结果表明，高糖显著上调FN和FSP1 mRNA表达，高渗组与对照组相比，无显著性差异，说明高糖上调肾小管上皮细胞FN 和FSP1 mRNA表达并不依赖于细胞所处的高渗环境；而转染Snail1 siRNA后显著下调高糖诱导的FN和FSP1 mRNA表达，分别达71%和77%（P<0.01）。

Control siRNA不影响高糖诱导的肾小管上皮细胞FN和FSP1 mRNA表达注：1.对照组，2.高糖组，3.Snail 1 siRNA处理组，4.Control siRNA处理组，5.高渗组；（1）与对照组比较，P＜0.01;(2)与高糖组比较，P＜0.01 　　3 讨论 前期的观察结果提示，糖尿病状态上调大鼠肾小管上皮细胞Snail 1的表达[5，6]DN的发病机制虽然纷繁复杂，但其始动环节为血糖显著升高，因此本次实验观察了高糖作用下原代肾小管上皮细胞中Snail 1的表达结果表明，原代肾小管上皮细胞在高糖刺激72 h后，无论是Snail 1 mRNA还是蛋白均显著增加，说明高糖状态能上调Snail 1表达过多的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积是肾脏纤维化重要的病理变化，而FN是ECM的重要组成成分前期的研究发现DN大鼠Snail 1与FN mRNA表达水平呈显著正相关[5，6]，在高糖培养的肾小管上皮细胞中FN表达亦增加，提示了Snail 1参与FN生成增多的机制RNA干扰(RNA Interference, RNAi)是指通过正、反义RNA片段形成双链RNA,从而特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象[8]。

作为高效、特异的调节基因表达技术, RNAi已成为基因功能研究的有力工具[9]通过RNAi可以非常有效地下调某种特定基因的表达水平,并可快速高效地研究该基因功能及与其它基因之间的相互关系[10，11]因此，选用RNAi技术观察Snail 1基因与高糖诱导的FN之间的相互关系，以进一步探讨该基因在ECM沉积中的作用实验中利用转染Fluorescein Conjugated Control siRNA，在荧光显微镜观察到绿色荧光颗粒主要分布于核区，初步推断Snail 1 siRNA导入细胞核进一步经半定量RTPCR和Western blot进行检测，显示转染Snail 1 siRNA的肾小管上皮细胞在高糖刺激下Snail 1 mRNA和蛋白的表达被显著抑制，与未转染高糖组相比分别下降达62%和68%，说明RNA干扰技术对Snail基因表达抑制的有效性在Snail 1 mRNA和蛋白表达显著抑制的肾小管上皮细胞，高糖诱导的FN表达被显著抑制，提示Snail 1基因对高糖诱导下肾小管上皮细胞FN的表达具有调控作用有研究表明Snail 1基因是E-钙黏素特异性转录抑制子，Snail 1能与Ecadherin启动子特异性Ebox元件结合，抑制Ecadherin转录，从而触发上皮细胞向间充质细胞转变，使上皮细胞丧失细胞间紧密黏附性，继而FN、Vimentin、FSP1等基因表达上调[12～14]。

在高糖刺激下，肾小管上皮细胞FSP1和Vimentin较正常组显著增加，说明肾小管上皮细胞发生了表型转变，成为具有分泌ECM能力的间充质细胞；而在Snail 1 siRNA处理组，FSP1和Vimentin的表达亦被显著抑制，提示Snail 1与FSP1和Vimentin之间存在密切的调控关系推测在高糖作用下，上调的Snail 1具有触发肾小管上皮细胞向间充质细胞转变的作用，而当Snail 1 siRNA抑制Snail1表达后，阻断了肾小管上皮细胞表型转变，因而FN表达减少本次实验尚不能阐述Snail 1在肾小管上皮细胞向间充质。